乳清蛋白水解物：让“会过敏的营养”，成为更多人能安心补的营养

每天喝牛奶，本是再平常不过的事。但对牛奶蛋白过敏的人群来说，一杯牛奶可能意味着腹胀、皮疹甚至更严重的不适——问题出在乳清蛋白中的致敏成分，尤其是占乳清蛋白一半左右的β-乳球蛋白。

乳清作为奶酪加工的副产物，蕴藏着丰富优质蛋白资源，是开发营养配料的优质原料。但天然乳清蛋白存在致敏性问题，制约其在特殊人群营养产品中的落地。

能不能留住乳清蛋白的优质营养，同时大幅降低致敏性？答案藏在酶水解技术里。科学家用特定的酶，精准“剪断”蛋白质中的抗原表位，同时保留高含量的必需氨基酸，把普通乳清变成了低致敏、易吸收、渗透压适宜的短肽产品。它不仅能替代脱脂乳，还有望成为运动营养饮品和预防性食品的优质原料。

这项研究究竟是怎么做到的？水解产物又有哪些实际应用？本文结合酶水解实验，从化学成分、肽谱、渗透压三大维度，为你解析乳清蛋白水解物的营养特性与食品应用前景👇

乳清蛋白水解物的营养学评价:化学成分、肽谱和渗透压

摘要：

乳清加工的可行性已得到其成分价值、原料数量以及基于乳清可制备多种食品和配料的潜力所证实。在食品工业中，降低乳清蛋白抗原性的最适宜工艺方法是酶水解。本研究旨在分析采用酶制剂Promod 439L与 Flavorpro 766MDP对奶酪乳清超滤浓缩物进行酶水解后所得产物的化学组成及性质，以确定所得水解产物的加工应用方向。实验结果表明：在β-乳球蛋白与α-乳白蛋白的抗原表位中，分别有65%与40%的肽键被断裂，且食品体系的渗透压未见显著升高（水解产物中渗透压为291±2 mOsm/dm³）。蛋白水解产物中以短链肽类为主，所得产物具有降低的致敏性和较高的必需氨基酸含量。该水解产物可广泛应用于多种乳制品工艺：在配制标准化混合物时替代脱脂乳，用于生产对牛奶蛋白过敏人群的预防性营养产品制备，以及作为运动营养饮品的主要原料。

关键词：干酪乳清超滤浓缩物；酶水解；分子量分布；肽谱；化学组成；理化性质。

实际应用：研究结果可用于在标准化混合物中替代脱脂乳，并可作为饮品的主要原料。

引言：

俄罗斯联邦至2030年的《粮食安全安全学说》旨在为民众提供高质量、安全的食品，以保障积极健康的生活方式。与此同时，资源节约、遵守环境安全标准、合理利用自然资源以及环境保护，是国家可持续发展战略当下的优先方向。俄罗斯联邦食品企业的主要任务是通过引进最佳可行技术，减少其经济活动对环境造成的负面影响。在乳制品行业，这些企业专注于利用年产量持续增长的低值原料（乳清）进行加工（Trindade 等，2019； Khramtsov ，2019）。2020年，俄罗斯乳清总产量约为1000万吨。按绝对干物质计算，其总量仅为数十吨。

乳清加工的实用性已得到以下因素的证实：乳清具有宝贵的蛋白质-碳水化合物-矿物质组成；多种原料易于获取（占俄罗斯联邦加工乳量的1/5），并且基于乳清可开发种类丰富、附加值高的食品和配料。这可以通过按分子大小对乳清组分进行分级分离来实现。所采用的方法包括微滤、超滤、渗滤、反渗透和电渗析。与此同时，乳清蛋白浓缩物需求量最大，因为它们能表现出重要的理化性质，如保脂性、保水性、乳化性，并在食品体系中发挥多种工艺功能（Guralnick et al., 2021）。此外，乳清蛋白浓缩物不具备食品添加剂地位，也无“E 编号”，因而可为成品食品提供“纯净”标签（Nastaj 等，2019）。乳清的主要缺点之一是蛋白质组分具有致敏性，尤其是β-乳球蛋白，其含量可占所有乳清蛋白的50%（Agarkova et al., 2020）。β-乳球蛋白分子包含若干线性IgE结合表位，其中一些具有潜在致敏性，因为其长度不超过5个氨基酸残基。通过去除或裂解高分子量致敏组分（包括β-乳球蛋白），可降低乳清蛋白复合物的抗原性（Knol 等，2019）。由于天然乳清蛋白仅在分子保持三级结构时才会表现出免疫反应性，因此多种技术方法（热处理、高压处理、酶水解等）均可改变其致敏潜力（Wal，2004）。这会导致蛋白质分子发生构象转变，进而引起变性蛋白质的结构和可消化性发生变化，以及抗原表位的破坏或可及性受限。乳制品原料长时间加热会降低其营养价值，并可能导致产品溶解度下降和可消化性不足，这对于通过热变性降低致敏性而言是一个显著的缺点。

由高静水压引起的结构改变，主要采用的热力学方法是基于分子的可压缩性及其体积变化（∆V）（Lullien-Pellerin & Balny，2002）。这种物理作用会导致平衡向总体积最小的方向移动。压力对大多数球状蛋白的四级结构具有破坏作用（200 MPa），但对二级结构的影响相对较小（＞300–700 MPa）。蛋白质变性包括寡聚体蛋白质的解离、去折叠和聚集，而蛋白质的共价键仍保持完整。这些变化取决于蛋白质的结构与浓度、压力、温度、pH值、离子强度以及溶剂组成。加压变性是一个易于控制的过程，相较于温度或化学暴露，它引起的蛋白质球状结构重排程度较轻（Mazri et al.，2012）。

通过使用选择性特异性吸附剂从乳中去除乳球蛋白，可降低乳清蛋白的致敏潜力。其中最受关注的是采用壳聚糖这类特异性吸附剂对蛋白质物质进行沉淀处理，壳聚糖可选择性地与多种乳蛋白相互作用，形成不溶性复合物。需注意的是，壳聚糖是一种低毒且可生物降解的聚合物（Chen et al.2015；Evdokimov et al.2015）。

在食品工业中，乳清蛋白的酶水解是最合适的技术，该方法可制得具有特定分子量分布和残留抗原性的水解产物（Eberhardt et al., 2019; Brandelli et al., 2015; Martorell-Aragonés et al., 2015）。酶的选择依据是基于其对肽键类型的特异性，这决定了能否获得具有不同蛋白质水解程度的产物。利用蛋白质水解技术的一个重要优势在于，可获得易于消化的短链肽，这些短链肽对人体具有一定的生理作用（Brandelli et al., 2015; Tavares et al., 2011; Prosekov et al., 2016; Bamdad et al., 2017）。

水解产物是由肽段与游离氨基酸组成的混合物，其中部分组分可使水解产物产生苦味或后苦味。这是由于含有疏水性侧链的氨基酸之间的多肽键发生断裂所致。原始蛋白质和多肽中的疏水侧链无法与舌部受体结合，亦不参与后续味觉识别，因此不呈现苦味特征。在蛋白水解过程中，会形成较短长度的肽段，这些肽段可使原本隐藏的疏水区域暴露于分子表面，从而被舌部受体识别，水解产物的苦味随之增强。据文献报道，氨基酸侧残基的平均疏水性低于 1300 kcal/mol的肽不具有苦味（Acquah et al., 2018; Iwaniak et al., 2020）。

肽产生苦味的能力也取决于其分子量。关于位于每个受体腔中的受体位点的立体化学选择性，与分子体积因素有关（Fennema et al., 2017）。分子量小于6千道尔顿（6 kDa）的肽可能具有苦味，因为较大的肽无法进入受体位点。

为了获得具有合适感官特性的水解产物，建议采用蛋白酶与肽酶的组合进行可控蛋白质水解（Song 等，2020）。鉴于上述背景，本研究旨在探究采用Promod 439L和Flavorpro 766MDP酶制剂对奶酪乳清超滤浓缩物进行水解后，所得水解产物的化学组成及性质，以确定所得水解产物的加工应用方向。

Promod 439L是一种丝氨酸蛋白酶（源自地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis），其底物包括 β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。Flavorpro766 MDP 是氨基肽酶与羧肽酶的混合物（源自曲霉属 Aspergillus spp.）。该酶同时具备外肽酶与内肽酶的特性，能够切割具有高疏水性的氨基酸，从而降低所得肽段的苦味（Biocatalysts, 2021）。为实现这一目标，已制定以下任务：

— 鉴定游离氨基酸，并确定使用Promod 439L和Flavorpro766 MDP酶制剂对奶酪乳清超滤浓缩物进行水解后形成肽段的氨基酸序列；

— 基于分子量分布、生成肽段、肽段长度及电荷变化等分析，预测水解产物致敏性的降低；

— 评价所得水解产物的质量，并确定其在特定食品生产线中的应用可行性。

结果：

由于蛋白水解的程度和速率显著取决于蛋白质碳链中可水解键的位置以及相邻氨基酸残基侧基的化学性质，因此通过超滤提高底物与酶的比例，并将孵育时间设定为（6.0±0.5）小时。

在实验研究过程中，本研究评估了奶酪乳清超滤浓缩物中蛋白水解效率，鉴定了水解产物中肽段的氨基酸序列及其长度、分子量与电荷，并计算了平均疏水性。为获取客观数据，同时测定了干酪乳清超滤浓缩液样品中的相同指标。此外，本研究还系统分析了乳清蛋白水解产物的化学组成和理化性质（表2）。

表2. 乳清蛋白水解物的化学成分与性质

氨基酸序列采用单字母代码表示。质谱分析中确定的区段以灰色高亮显示（即至少发现一组肽段可按顺序或重叠方式覆盖该序列的标记部分）。此类肽段的示例以蓝色标记，标注于序列相应区段下方（图1）。含有最具代表性肽段的蛋白质序列，各个区段清晰可见。

图1. 乳清蛋白水解产物中的肽段——分别为以下物质的衍生物：(a) β-乳球蛋白；(b) α-乳白蛋白

实验样品包含分子量为561至1943 Da的含有5至17个氨基酸残基的β-乳球蛋白衍生物，以及分子量为528至1067 Da的含有5至9个氨基酸残基的α-乳白蛋白衍生物（图2）。奶酪乳清超滤浓缩物中存在的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的肽衍生物的长度为5至25个氨基酸残基，分子量为624至2817 Da。

图2. 实验样本中鉴定到的肽段分布：(a) 按分子量；(b) 按长度；(c) 按电荷数

蛋白水解作用通过部分氨基酸的裂解及其在表面的重新分布，导致肽链电荷发生改变，进而降低肽链的自缔合能力和整体疏水性。与此同时，由于蛋白质分子双电层的破坏，水解产物干物质中含氮组分的溶解度增加，这提高了其在高温巴氏杀菌过程中抗沉淀性的能力（图3）（Kramer et al.，2012）。

图3. 在 t = (80 ± 2) °C、τ = 15 sec 条件下巴氏杀菌后所研究样品的微观结构（放大倍率 600/0.85）：(a) 奶酪乳清超滤浓缩物；(b) 乳清蛋白水解产物

讨论：

研究结果表明，β-乳球蛋白与α-乳白蛋白发生了较高程度的水解。此外，β-乳球蛋白与β-乳白蛋白抗原表位中的肽键分别有65%与40%被断裂，且食品体系的渗透压并未显著升高。蛋白水解产物中以短链肽为主。与初始超滤浓缩物相比，水解产物中引发苦味的游离氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸）含量变化不大（图4）。因此，所得乳清蛋白水解产物具有以下特点：致敏性降低、必需氨基酸及支链氨基酸含量较高，且无苦味。该产物可快速补充机体流失的水分与能量，且不会引起胃肠道渗透失衡。

图4. 乳清蛋白水解物中的总含量及游离氨基酸含量。

根据文献（Tavares et al., 2011；Prosekov et al., 2016；Bamdad et al., 2017），某些短链肽因其含有特定氨基酸而具有抗氧化特性。肽与自由基的结合是通过疏水性末端氨基酸实现的，例如丙氨酸（Ala, A）、脯氨酸（Pro, P）、缬氨酸（Val, V）、异亮氨酸（Ile, I）、亮氨酸（Leu, L）、苯丙氨酸（Phe, F）、色氨酸（Trp, W）、酪氨酸（Tyr, Y）以及甲硫氨酸（Met, M）。此外，带有芳香残基的氨基酸（组氨酸(H)和脯氨酸(P)）可向带电自由基提供电子。由于这些氨基酸作为蛋白水解所形成的肽的末端残基存在（图1），因此乳清蛋白水解物可被推荐作为应对氧化应激的一种有效手段。

已开展的实验研究存在的局限性在于：难以使酶制剂完全失活并将其从水解物中分离，该问题会影响所得结果的可靠性与结果解释。

结论：

基于实验数据，已证明使用Promod 439L和Flavorpro 766MDP酶水解奶酪乳清超滤浓缩物中的蛋白质，以获得具有适宜感官特性的低渗透压短链肽的有效性。后续研究将重点关注乳清蛋白水解产物的贮藏稳定性，以及质量与安全参数的测定。所得水解产物可应用于多种乳制品工艺中，在制备标准化混合物时替代脱脂乳，在考虑产品感官特征分析的基础上（Tirloni et al., 2019），也可作为运动营养饮料的主要成分。这将有助于扩大国产预防性营养产品的品类，服务于对牛乳蛋白过敏的人群，并推动功能性食品领域的进口替代。

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