细胞年轻とLPS泛菌糖脂质

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LPS激活的巨噬细胞促进成纤维细胞合成透明质酸和弹性蛋白

摘要

背景/目的:

巨噬细胞的功能会随着环境因素如脂多糖(LPS)的影响而发生改变。当经皮给药时，来自成团泛菌的LPS(LPSp)参与巨噬细胞活化和组织修复。LPSp激活的巨噬细胞可用于恢复和维持皮肤的稳态体内平衡。

材料和方法:

用LPSp激活佛波醇肉豆蔻酸酯处理的人单核细胞(THP-1细胞)。将LPSp活化的THP-1细胞的培养基加入到正常人皮肤成纤维细胞(NHDF细胞)中。24小时后，采用定量实时PCR分析在NHDF细胞中透明质酸(HA)合酶(HAS)2、透明质酸酶(HYAL)1和原弹性蛋白的表达。结果:

HAS2和原弹性蛋白的表达显著增加，而HYAL1的表达显著减少。研究结果表明，通过LPSp激活的THP-1细胞，NHDF细胞合成透明质酸和弹性蛋白的能力增强。

结论:

LPSp激活的巨噬细胞可能有助于增强成纤维细胞合成透明质酸和弹性蛋白的能力，从而改善功能障碍，减少各种与年龄相关疾病。

关键词：单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、透明质酸、弹性蛋白、脂多糖(LPS)。

单核细胞迁移到组织中，并根据微环境分化成具有组织特异性的巨噬细胞。巨噬细胞识别并清除外来物质，并在维持体内平衡中发挥重要作用(1-4)。在患有肥胖症患者的肿瘤组织或脂肪组织中积累的巨噬细胞将与癌细胞或脂肪细胞相互作用，导致炎性细胞因子的产生增加，并导致组织内的炎症变化。因此，这些巨噬细胞被认为诱导慢性炎症，慢性炎症与恶性肿瘤和生活方式相关疾病的发展有关(5-7)。因此，认为巨噬细胞的功能可以根据环境因素而改变。

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的胞外膜成分。被LPS激活的巨噬细胞诱导炎性细胞因子(8)的表达。相比之下，也有报道称，通过与癌细胞或脂肪细胞共培养，单核细胞/巨噬细胞中炎性细胞因子表达的增加可通过用低剂量LPS预处理而得到抑制，所述LPS来源于大肠杆菌(LPSe)(9-12)。因此，这表明巨噬细胞的功能可以在对环境因素如低剂量LPSe的反应中由炎症变为抗炎。此外，脂多糖来源于成团泛菌(LPSp)已经被证明具有组织修复作用，并且当口服和皮肤给药时LPS是无毒的(13)。据报道，LPS的功能更接近于外激素而不是内毒素(14)。因此，LPSp激活的巨噬细胞可能是无害的，并可用于恢复和维持肠道和皮肤的稳态。

在皮肤的真皮层中，巨噬细胞和成纤维细胞被认为相互作用以维持体内平衡。成纤维细胞产生细胞外基质成分，如透明质酸(HA)、弹性蛋白和胶原蛋白。HA是以高浓度存在于皮肤组织中的高分子量的多糖(15)。HA可以保持水分，具有粘性，对维持组织结构至关重要。HA还参与细胞增殖、分化、发育和伤口愈合(16-18)。弹性蛋白是一种不溶性蛋白，广泛分布于皮肤组织(19)中。弹性蛋白是弹性纤维的主要成分之一，参与维持皮肤的结构和物理特性(强度和粘弹性)。因此，由成纤维细胞产生的透明质酸和弹性蛋白，两者都在维持皮肤的结构和功能中发挥重要作用。

成纤维细胞合成的透明质酸和弹性蛋白的量随着年龄的增长而减少，从而降低皮肤组织的功能(20，21)。因此，增加皮肤组织中成纤维细胞合成的HA和弹性蛋白的量可以改善功能障碍并减少各种与年龄相关的疾病（如骨关节炎）的影响。然而，LPSp激活的巨噬细胞对成纤维细胞的作用尚不清楚。在这项研究中，我们研究了成纤维细胞通过LPSp激活的巨噬细胞中合成透明质酸和弹性蛋白的变化。

材料和方法

细胞。人单核细胞(THP-1细胞)从美国典型培养物收藏，正常人真皮成纤维细胞(NHDF细胞)从Kurabo (Kurabo Industries，Ltd .，Osaka，Japan)获得。THP-1细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（日本大阪市FUJIFILM和光纯化学株式会社）中培养，并添加100单位/毫升的青霉素和链霉素（日本大阪市FUJIFILM和光纯化学株式会社）。NHDF细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基（日本大阪市FUJIFILM和光纯化学株式会社）中培养，并添加100单位/毫升的青霉素和链霉素（日本大阪市FUJIFILM和光纯化学株式会社），在37℃、5% CO₂ 环境中孵育。

添加LPSp激活的THP-1细胞培养基。THP-1细胞以5×10^5/ml的密度接种于培养皿中。用5 ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)处理THP-1细胞48小时，并用100 ng/ml LPSp (Macrophi Inc .，Kagawa，Japan)激活。在用LPSp活化后24小时收集THP-1细胞培养基。NHDF细胞以3×10^5的密度接种于培养皿中。24小时后，除去NHDF细胞培养基，并向NHDF细胞中加入等量的LPSp激活的THP-1细胞培养基和DMEM培养基。然后，在37℃、5% CO₂ 环境中孵育24小时。

RNA提取。根据制造商的方案，使用TRIzol®试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)从NHDF细胞中提取总RNA。通过260 nm处的吸光度来定量RNA。。使用RevertAce® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（日本大阪市Toyobo株式会社）合成cDNA。

定量实时PCR。使用iQ™ SYBR® Green super mix(Bio-Rad Laboratories，Inc .，Hercules，CA，USA)进行实时PCR。PCR条件设置为95℃预变性10分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性10秒、60℃退火化30秒和72℃延伸30秒。通过将目标基因表达标准化为管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行相对定量分析。

统计分析。数据用学生的进行分析t-测试(Excel 2013)。使用和不使用LPSp的刺激之间的差异在p<0.05时被认为具有统计学意义。

结果

LPSp激活的巨噬细胞对透明质酸合成的影响。

HA合成和降解之间的平衡被认为对于HA的功能表达十分重要(22)。HA由三种类型的HA合酶(HAS)合成。据报道，HAS2是皮肤真皮中HA合成的主要贡献者(23)。HA被透明质酸酶降解。HYAL有几种类型，其中HYAL1主要从成纤维细胞释放（24）。我们研究了在用LPS激活的THP-1细胞培养基处理后NHDF细胞中HAS2和HYAL1的表达情况。通过LPS（100 ng/ml）激活的THP-1细胞显著增加了NHDF细胞中HAS2的表达（p=0.0027）。此外，通过LPS（100 ng/ml）激活的THP-1细胞(p=0.0013)显著降低了NDF细胞中HYAL1的表达 (图1)。结果表明，LPSp激活的THP-1细胞提高了NHDF细胞合成HA的能力。

图一。

LPSp激活的巨噬细胞对NHDF细胞HAS2和HYAL1基因表达的影响。使用定量实时PCR分析NHDF细胞中HAS2和HYAL1的mRNA表达。通过将目标表达标准化为GAPDH的表达来进行相对定量。*p<0.01。

LPSp激活的巨噬细胞对弹性蛋白合成的影响。

弹性蛋白由皮肤真皮中的成纤维细胞分泌，作为原弹性蛋白，成熟弹性蛋白的可溶性前体(19)。弹性蛋白纤维具有非常长的周转时间(25,26)。我们研究了LPSp激活的THP-1细胞对NHDF细胞中tropoelastin表达的影响。我们发现，通过LPS（100 ng/ml）激活的THP-1细胞显著增加了NHDF细胞中tropoelastin的表达（p=0.0005）（图2）。这表明，通过LPSp激活的THP-1细胞，NHDF细胞中弹性蛋白的合成能力得到了增强。

图二。

LPSp激活的巨噬细胞对NHDF细胞原弹性蛋白基因表达的影响。使用定量实时PCR分析NHDF细胞中原弹性蛋白的mRNA表达。通过将目标表达标准化为GAPDH的表达来进行相对定量。*p<0.01。

LPSp激活的巨噬细胞对胶原合成的影响。

I型胶原在脊椎动物中最丰富，包含α1链(COL1A1)和α2链(COL1A2) (27)。据报道HSP47的表达总是与COL1A1和COL1A2的表达相关（28）。此外，HSP47基因敲除小鼠特异性地具有异常的I型胶原（29）。我们通过LPSp激活的THP-1细胞研究了NHDF细胞中COL1A1、COL1A2和HSP47的表达。通过LPSp（100 ng/ml）激活的THP-1细胞在NHDF细胞中COL1A1、COL1A2和HSP47的表达没有显著差异（图3）。结果表明，LPSp激活的THP-1细胞并没有改变NHDF细胞中I型胶原合成的能力。

图3。

LPSp激活的巨噬细胞对NHDF细胞中COL1A1、COL1A2和HSP47基因表达的影响。使用定量实时PCR分析NHDF细胞中COL1A1、COL1A2和HSP47的mRNA表达。通过将目标表达标准化为GAPDH的表达来进行相对定量。

讨论

皮肤是一个不断与外界环境接触的器官。因此，许多免疫细胞如巨噬细胞存在于皮肤组织中。皮肤中的巨噬细胞通过与细胞如成纤维细胞相互作用来维持体内平衡。成纤维细胞产生细胞外基质，如透明质酸（HA）、弹性蛋白和胶原蛋白。HA对于维持组织结构是必不可少的，但也参与细胞增殖、分化、发育和伤口愈合(16-18)。人体中大约50%的HA存在于皮肤组织中，皮肤组织中大约三分之一的HA每天被替换(24, 25)。因此，认为HA合成和降解之间的平衡对于HA的功能表达是重要的(22)。我们的研究结果表明，HAS2的表达可以通过LPSp激活的巨噬细胞显著增加，而降解HA的HYAL1表达在NHDF细胞中可以显著降低（图1）。因此，LPSp激活的巨噬细胞可有助于增强成纤维细胞中HA合成的能力，从而改善功能障碍并减少各种与年龄相关的疾病，如骨关节炎。

弹性蛋白是弹性纤维的主要成分之一。弹性蛋白参与维持皮肤的结构和物理特性(19)。我们的研究结果表明，通过LPSp激活的巨噬细胞可以显著增加NHDF细胞中弹性蛋白的表达（图2）。在皮肤中，弹性蛋白纤维的周转时间非常长。一旦弹性蛋白纤维耗尽，由于再生过程漫长，很难重建（25, 26）。因此，建议通过LPSp激活的巨噬细胞增强成纤维细胞中弹性蛋白合成的效果可能有助于通过重塑弹性蛋白进行组织修复。

胶原蛋白是皮肤组织中细胞外基质的主要成分。胶原蛋白是一种蛋白质，在脊椎动物中大约有29种。I型胶原蛋白在脊椎动物中最丰富，并与弹性和强度有关(27)。众所周知，胶原蛋白的合成和降解速度比其他蛋白质慢。结果表明，用LPSp激活的巨噬细胞在24小时内NHDF细胞中I型胶原蛋白的合成能力没有变化（图3）。可能由于LPSp激活时间较短(24小时),导致成纤维细胞中胶原合成量没有增加。胶原蛋白合成量不随年龄变化，但胶原蛋白降解量随年龄增加(30)。这可以解释为什么没有观察到成纤维细胞中胶原合成量的变化。因此，有必要研究由LPSp激活的巨噬细胞诱导的成纤维细胞中胶原蛋白的降解量。

透明质酸（HA）和弹性蛋白合成的减少导致老年人皮肤组织功能的减退。据报道，LPSp的口服和经皮给药是无毒的，并且具有组织修复效果(13)。我们的研究结果表明，LPSp激活的巨噬细胞可以增强成纤维细胞中HA和弹性蛋白的合成，从而改善皮肤功能并减少各种年龄相关疾病的影响。

作者贡献

TH和ST进行了实验。CK和HI设计了实验。所有作者都对数据收集和解释做出了贡献。TH撰写了手稿，ST、CK和HI对稿件进行了关键修订。

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