水解乳清蛋白诞生记｜解锁小分子肽更快吸收的秘密！

提到"优质蛋白"，乳清蛋白几乎是绕不开的名字。它被誉为"蛋白质之王"，消化吸收快、活性成分丰富，在运动营养和功能性食品领域备受青睐。

但这样的"王者"身份，并非与生俱来。它的起点，其实是奶酪生产中的一道副产物——乳清。乳清是在生产干酪及干酪素过程中，除去酪蛋白沉淀后所得的物质。最初的乳清，吸收慢、热稳定性差，应用价值远不如今天。

转折点发生在酶解技术的应用。通过酶水解，大分子乳清蛋白被"剪裁"成小分子肽，不仅吸收速度大幅提升，还释放出多种具有生理功能的活性肽。乳清蛋白由此完成了从"大块头"到"小精兵"的蜕变。

这份吸收上的差距背后藏着什么？让我们从乳清的诞生说起。

乳清是在生产干酪及干酪素过程中，除去酪蛋白沉淀后所得的物质，具有很高的营养价值。乳清直接烘干所得的乳清粉中，乳清蛋白所占含量一般为百分之十几，不超过百分之三十。乳清蛋白是一种优质蛋白，常被用作人体优质蛋白补充剂，素有“蛋白质之王”之称，它不仅易被消化吸收，而且还含有多种活性成分。乳清蛋白的许多功能性质，如成胶性、持水性、搅打起泡性、乳化性、涂层性、微胶束化等在食品中均有广泛的应用。乳清蛋白虽有很多优点，但由于它是大分子蛋白，在肠道中需经水解成短肽和游离氨基酸后方可被吸收，且对热、酸敏感，易变性，变性后溶解度降低，限制了它在食品中的应用。而乳清蛋白水解物则是乳清蛋白经水解后得到的产物，其大部分构成成分是小肽及氨基酸，改善了乳清蛋白对热酸的敏感性。大多数学者研究表明，乳清蛋白经水解后还会释放出一些具有特定活性的氨基酸序列，即活性肽，它们具有特殊的生理功能。随着对乳清蛋白水解物研究的不断深入，它在食品中的应用也越来越多样化[*1]。

参考文献：[*1]孙景珠, 赵丽双, 刘丽波, 等. 乳清蛋白水解物的研究进展及应用[J]. 食品工业科技, 2019, 40(1): 316-320, 325.

经Alcalase与Protamex处理后采用Flavourzyme制备的乳清蛋白水解物的特性与吸收率

摘要：

本研究旨在评估乳清蛋白水解物的理化特性，并确定酶水解对其吸收速率的影响。通过采用 Superdex G-75凝胶色谱柱对乳清蛋白浓缩物（WPC）和低分子量乳清蛋白水解物（LMWPH）进行分子量分布分析，结果表明，低分子水解乳清蛋白所含肽段分子量小于浓缩乳清蛋白。傅里叶变换红外光谱检测分析显示，WPC与LMWPH的吸收峰位置存在差异，表明水解介导了二级结构的变化。此外，与WPC相比，LMWPH具有更高的热稳定性和更快的肠道渗透速率。另外，口服LMWPH后20 min时血清蛋白含量即升高，而WPC则需40 min后使血清蛋白含量才逐渐升高。尽管WPC与LMWPH的总吸收量相近，但LMWPH的吸收速率更高。综上所述，LMWPH作为WPC的水解产物，具有独特的理化性质和更优越的吸收特性。LMWPH由低抗原性的低分子量肽组成，与WPC相比吸收效果更佳。因此，LMWPH可作为高生物利用度的蛋白源，用于功能性产品的开发。

引言：

乳清是奶酪生产过程中的副产品，约占乳蛋白总量的20%，被认为是一种蛋白质来源[1]。乳清蛋白具有多种营养和生理功能。它包含四种主要蛋白质：α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-LG）、免疫球蛋白和牛血清白蛋白（BSA）[2,3]。乳清水解物通过酶水解作用降低抗原性，被认为是一种低致敏性功能原料[4]。采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白水解酶处理乳清蛋白所获得的乳清水解物，含有具有多种生理功能的生物活性肽。乳清蛋白水解物中活性肽的种类取决于水解所用的酶[5]。这些生物活性肽包括阿片样肽、血管紧张素I转换酶抑制肽、抗血栓形成肽、免疫调节肽、矿物质转运肽、抗氧化肽以及具有抑制肌肉流失活性的肽类[6,7]。

蛋白质水解产物中所含的二肽和三肽比蛋白质或氨基酸吸收更快，能有效提供蛋白质[8,9]。已有研究表明，使用蛋白水解酶从乳清蛋白浓缩物（WPC）水解得到的低分子量乳清蛋白水解物（LMWPH）含有大量支链氨基酸。在C57BL/6小鼠中的实验显示，LMWPH已被证实可通过PI3K/Akt/mTOR通路促进肌肉蛋白质合成，并通过PI3K/Akt/Foxo3a通路抑制肌肉蛋白质降解[10]。此外，确定生物活性肽的稳定性至关重要，因为这些肽可能与其他食物成分发生相互作用，或在胃肠道消化过程中被进一步水解[11,12]。吸收后，肽会被肠上皮细胞中的肽酶和血液中的蛋白酶水解，进而影响其生物活性[13]。因此，评估蛋白水解物水解前后的生物利用度及其生理活性具有重要意义。

本研究旨在探究乳清蛋白经酶水解后的理化性质及其消化吸收速率。LMWPH是采用三种蛋白酶（Alcalase、Protamex和Flavourzyme）对WPC进行联合处理制备而成。通过尺寸排阻色谱法确认了WPC和LMWPH的分子量分布。此外，利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析评估水解引起的二级结构变化，并采用差示扫描量热法（DSC）评价其热学特性。经消化酶处理后，对WPC和LMWPH的Caco-2细胞模型及肠道通透性进行了研究，并通过SD大鼠单次灌胃给药评估了血清吸收速率。

结果

1.WPC和LMWPH的分子量分布

采用Superdex G-75层析柱对WPC和LMWPH的分子量分布进行测定。WPC的分析结果显示在18 kDa处出现一个大峰，在186 kDa和5.8 kDa处出现小峰（图 1a）；而LMWPH 的分析结果显示在1.0 kDa、408 Da和259 Da处显示大峰（图 1b）。LMWPH由比WPC中分子量更小的肽组成。WPC样品中18 kDa处出现的峰归因于β-乳球蛋白（β-LG） ，已知其在乳清蛋白中的含量最高；然而，在LMWPH样品中未检测到该峰。

图1. 乳清蛋白浓缩物（WPC）的分子量分布。

2.WPC与LMWPH的FT-IR光谱分析

WPC的FT-IR光谱分析显示在1630 cm⁻¹和1524 cm⁻¹处出现强吸收峰，而LMWPH的FT-IR光谱则在1633 cm⁻¹与1516 cm⁻¹处出现吸收峰（图2）。两份样品均在16001700 cm⁻¹ 区间出现吸收峰，该区域对应酰胺Ⅰ带。同样，两份样品都在15001600 cm⁻¹ 区间也均显示吸收峰，对应酰胺Ⅱ带。此外，WPC在1157、1312、1389、1447 cm⁻¹ 处出现吸收峰；而LMWPH的吸收峰则出现在 1172、1196、1230、1303、1444 cm⁻¹，以上峰位均归属于酰胺Ⅲ带（1100-1500 cm⁻¹）。总体而言，WPC与LMWPH在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 特征区域的吸收峰存在差异。WPC和LMWPH分别在3277 cm⁻¹、3271 cm⁻¹处显示宽峰，并分别在3074 cm⁻¹、3066 cm⁻¹处伴有小肩峰。WPC和LMWPH也均在 2925 cm⁻¹ 检测到一处小吸收峰。

图2. WPC（a）和LMWPH（b）的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。

使用Prota-3S™软件，对浓缩乳清蛋白（WPC）与低分子水解乳清蛋白（LMWPH）在 1600-1700 cm⁻¹ 区间（酰胺Ⅰ带区域）的二级结构含量进行分析（表1）。WPC中β-折叠的含量为36.41%，而LMWPH中该含量降至28.20%。此外，LMWPH中α-螺旋结构的含量为35.61%，高于其他二级结构的含量。这种由水解作用引发的二级结构含量变化，可能归因于WPC中主要蛋白质β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）的降解。

表1. 浓缩乳清蛋白（WPC）和低分子乳清蛋白水解物（LMWPH）的二级结构含量。

3. WPC与LMWPH的热学性质

采用差示扫描量热法（DSC）对WPC与LMWPH的热学性质进行分析（图S1和表2）。根据峰1和峰2的起始温度（Tₛ）与终止温度（Tₑ）可看出，WPC的热稳定性略低于LMWPH。峰1处的变性温度（Tmax）在 WPC中为53.23°C ，在LMWPH中为94.99°C。而峰2处的变性温度在WPC中为120.81°C，在LMWPH中为164.14°C。这些结果表明，水解作用提高了LMWPH的热稳定性。这些结果表明，水解提高了LMWPH的热稳定性。

图S1.（a）浓缩乳清蛋白（WPC）和（b）低分子乳清蛋白水解物（LMWPH）的差示扫描量热法热谱图。

表2. 浓缩乳清蛋白（WPC）和低分子乳清蛋白水解物（LMWPH）的变性温度及相关焓变（∆H）。

4.体外消化

分别测定浓缩乳清蛋白（WPC）与低分子水解乳清蛋白（LMWPH）在经消化酶（胃蛋白酶和胰酶）处理前后的总蛋白含量（图3a）。结果显示，WPC与LMWPH在消化酶处理前的总蛋白含量显著高于处理后（p < 0.05）。此外，消化酶处理前WPC的蛋白含量显著高于LMWPH（p < 0.001；图3a）。消化酶以时间依赖性方式显著降低了蛋白含量（p < 0.05；图3a）。

图3. 体外胃肠消化后浓缩乳清蛋白（WPC）和低分子乳清蛋白水解物（LMWPH）的总蛋白及氨基氮含量。

此外，消化酶使WPC中的氨基氮含量从63.82 mg增加至254.84 mg，增幅达299.3%。然而，由于LMWPH已被酶预先水解，消化酶对其氨基氮含量的增幅较小。由于WPC由高分子量肽组成，经消化酶处理后其氨基氮含量显著增加。这些结果表明，LMWPH中所含的活性肽对消化酶具有耐受性。

5.采用Caco-2细胞分析消化酶处理前后WPC和LMWPH的肠道通透性

本研究评估了经不同消化酶处理后，WPC与LMWPH对Caco-2细胞通透性的影响（图4）。在所有消化酶处理过程中，WPC在40 min时表现出较高的Caco-2细胞通透性，其中胃蛋白酶处理的细胞通透性显著高于其他处理时间点（p < 0.05，图4a）。在WPC处理40 min时，与消化酶处理之前（14.36%）相比，胃蛋白酶与胰酶联合处理增加了Caco-2细胞通透性（18.45%）。LMWPH在所有消化过程中，20 min时的Caco-2细胞通透性均显著高于其他处理时间点（p < 0.05，图4b）。在LMWPH处理20 min时，胃蛋白酶与胰酶联合处理（25.01%）的肠道通透性高于消化酶处理前（19.40%）。经消化酶（胃蛋白酶和胰酶）处理后，根据不同处理时间比较WPC和LMWPH的Caco-2细胞通透性。在处理20 min和120 min时，LMWPH的肠道通透性均显著高于WPC（分别为p < 0.001和p < 0.01，图4c）。而在处理40 min和60 min时，WPC和LMWPH之间的Caco-2细胞通透性无显著差异。因此表明，LMWPH比WPC在更短时间内表现出更高的肠道通透性。

图4. 体外胃肠消化后浓缩乳清蛋白（WPC）和低分子乳清蛋白水解物（LMWPH）的Caco-2细胞渗透性。

6.采用肠囊法评估消化酶处理后WPC和LMWPH的肠道通透性

采用肠囊模型评估了消化酶处理后WPC和LMWPH的肠道通透性（图5）。随着肠道转运时间的延长，透过肠囊的蛋白质和氨基氮含量均逐渐增加。此外，根据渗透时间的变化，WPC和LMWPH的蛋白和氨基氮渗透模式相似。在所有时间点，LMWPH的蛋白（p < 0.001；图5a）和氨基氮（分别为p < 0.001和p < 0.05，图5b）渗透量均显著高于WPC。综上所述，肠囊模型也证实了LMWPH的肠道通透性高于WPC。

图5. 采用肠囊模型，WPC组和LMWPH组中渗透蛋白和氨基氮含量的变化。

7.SD大鼠单次高剂量给药后样品吸收速率的评估

口服给予WPC和LMWPH后，在不同时间点测定血清蛋白和氨基氮含量（图6）。口服给予LMWPH后20 min时血清蛋白含量达到最高，随后逐渐下降。与之相反，口服给予WPC后40分钟时，血清蛋白含量才开始逐渐升高（图6）。此外，口服给药后20 min，LMWPH的血清蛋白含量显著高于WPC（p < 0.01；图6a）。相反，口服给药后120 min，WPC的血清蛋白含量显著高于LMWPH（p < 0.05，图6a）。

图6. SD大鼠经口给予LMWPH和WPC后血清蛋白和氨基氮含量的变化。

LMWPH组在口服给药后20 min时血清氨基氮含量达到最高，随后逐渐下降。与之相反，WPC组在口服给药后20 min至60 min期间氨基氮含量相近，120 min后出现下降（图6b）。口服给药20 min后，LMWPH组的氨基氮含量显著高于WPC组（图4b）。LMWPH单次口服给药后20 min的吸收速率较高，而WPC的吸收速率较低。

口服给予WPC和LMWPH后，蛋白质吸收的曲线下面积（AUC）相近，分别为8266和8199 mg·min/mL。同样，口服WPC和LMWPH后，氨基氮吸收的AUC也相近，分别为822.8和825.9 mg·min/mL。

讨论

源自乳清蛋白的生物活性肽可通过热处理、化学水解、酶解和发酵等方式水解蛋白质而制得[14]。酶水解是首选的提取方法，主要使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶及碱性蛋白酶等蛋白酶。乳清来源的肽具有抗氧化、抗菌、降压和抗炎等生理活性。通过多种酶的组合可产生具有广泛生理特性的肽[15]。尽管乳清蛋白被认为是相对安全的蛋白质，但对乳源性过敏的担忧仍然存在。然而，已知低分子量乳清肽可显著降低抗原性[16]，因此有必要通过酶解去除主要抗原β-乳球蛋白（β-LG），提取低分子量乳清来源肽。本研究中所用的LMWPH是在Alcalase和Protamex处理后再经Flavourzyme进一步水解制得，因其具有抑制肌肉流失的活性[10]，在功能性食品领域具有潜在应用价值。因此，本研究对LMWPH的特性及消化吸收速率进行了评估，为其在功能性食品开发中的应用提供依据。

乳清蛋白水解物的特性归因于乳清蛋白中的主要蛋白质：β-乳球蛋白（β-LG）、α-乳白蛋白（α-LA）。α-LA约占乳清蛋白的20%，含有八个半胱氨酸残基，形成四个二硫键。α-LA中的α-螺旋和β-折叠区域具有较强的钙结合力[17]。此外，β-LG占乳清蛋白的65%,由162个氨基酸残基组成，包含五个半胱氨酸残基，以两个二硫键和一个游离巯基的形式存在[18]。β-LG主要由β-折叠结构组成，其结构比α-LA的α-螺旋形式更为简单[19]。由于蛋白质水解而预期发生的蛋白质结构变化，可通过FT-IR光谱分析进行观察。在WPI和LMWPH中均观察到2925 cm⁻¹处的吸收峰，该谱带（2925 cm⁻¹）与N-H伸缩振动相关[20]。两份样品在 3700-2800 cm⁻¹ 范围内出现的宽峰，主要与O-H伸缩振动、C-H伸缩振动和残留水分有关[21]。WPC和LMWPH在3074 cm⁻¹和3066 cm⁻¹处的肩峰对应于C＝C-H伸缩振动[22]。酰胺I区的吸收被认为对蛋白质二级结构的FT-IR分析最有用。在酰胺I区可观察到α-螺旋（1646-1664 cm⁻¹）、β-折叠（1615-1637 cm⁻¹、1682-1700 cm⁻¹）、β-转角（1664-1681 cm⁻¹）以及无规卷曲（1637-1645 cm⁻¹）等二级结构信号[23]。

相较于α-乳白蛋白（α-LA），β-乳球蛋白（β-LG）更易与消化酶接触，因此更容易被水解 [17,24]。本研究中，LMWPH的水解改变了主要蛋白质的二级结构，降低了β-折叠结构的含量，增加了α-螺旋结构的比例（表1）。当乳清蛋白被内切蛋白酶Alcalase和Protamex水解使N端增加时，较小的肽似乎被外切蛋白酶Flavourzyme进一步水解[25]。此处，图1a中WPC的色谱图在18 kDa处显示一个峰，对应于β-LG，而在LMWPH样品中未观察到该峰。蛋白质二级结构决定了其化学反应活性、分子间相互作用以及功能特性[23]。水解不仅引起了结构变化，还引起了WPC和LMWPH热性质的变化（图S1和表2）。热处理会进一步松散蛋白质结构，削弱内部的疏水键[26]。此外，热处理引起的蛋白质变性通过聚集作用降低溶解度[27]。由于热处理导致β-乳球蛋白聚集，乳清蛋白的浊度增加，但经酶处理的WPH由于酶灭活过程而未表现出浊度和黏度的变化[28]。同样，Oldfield等人[29]报道称，在喷雾干燥过程中的高温预热步骤中诱导了IgG的变性，但α-LA和β-LG的变化极小。酶水解作用可暴露蛋白质内部的疏水性氨基酸，增加水解产物的表面疏水性[30]，从而改变其热学性质。特别是，酶处理的乳清蛋白水解物随着水解度的增加热稳定性提高，即使在酸性pH条件下也表现出高溶解度[27]。

对具有上述特性的LMWPH进行消化吸收速率评估，表明其具有商业应用潜力。此外，采用人工消化酶处理分析消化率，利用Caco-2细胞分析通透性，既省时又经济，且可与水解物的体内研究建立显著的相关性[31]。蛋白质消化会增加游离氨基酸和肽的含量[32]。在本研究中，WPC经胃蛋白酶处理后氨基氮含量略有增加，但经胰酶处理后则迅速增加（图3）。此外，β-LG具有折叠结构，对胃蛋白酶有抗性，因为其胃蛋白酶切割位点处的疏水氨基酸在β-折叠结构内部形成了强疏水键[33,34]。然而，α-LA很容易被胃蛋白酶水解[35]。此处，胰液水解了β-LG，其在胰蛋白酶切割位点处分别含有15个赖氨酸残基和3个精氨酸残基[36]，从而迅速增加了氨基氮含量。已经过酶水解的LMWPH在经消化酶处理后，氨基氮含量仅发生轻微变化。

经消化处理的肽被小肠上皮细胞吸收，因此，利用Caco-2细胞进行通透性分析有助于预测其肠道吸收情况[37]。本研究中，氨基氮含量较高的LMWPH在20 min时肠道通透性最高，而WPC则在40 min时肠道通透性较高（图4）。在肠囊模型中，LMWPH表现出比WPC更高的肠道通透性（图5）。肽的大小和疏水性影响其向肠上皮细胞的渗透。当分子量超过500 Da时，生物利用度迅速下降[38]。LMWPH由比WPC更小的肽组成，且水解使内部的疏水性肽段暴露于表面，这一现象或许可以解释Caco-2细胞模型中渗透性的差异。在SD大鼠模型中，单次给药后血清蛋白和氨基氮的变化表明，LMWPH在口服后20 min吸收较快，而WPC的吸收则较缓慢（图6）。在时间依赖性吸收速率图中，WPC组和LMWPH组的蛋白和氨基氮AUC相似，分别为8266和8199 mg·min/mL以及822.8和825.9 mg·min/mL。WPC和LMWPH之间的AUC无显著差异，但LMWPH的吸收速率比WPC更快。同样，Farup等[39]报道，根据水解程度，乳清蛋白可显著增加血浆总氨基酸，且乳清蛋白水解物比酪蛋白更快地增加血浆总氨基酸。这种快速蛋白质吸收有助于血液氨基酸浓度的快速上升和全身蛋白质合成的加速[40]。缓慢消化的蛋白质主要从肠道吸收，而不是增加被外周血管吸收的血液氨基酸浓度。与快速消化的蛋白质相比，这导致肌肉蛋白质合成减少[41]。因此，快速吸收的LMWPH比缓慢吸收的蛋白质更有效地刺激肌肉蛋白质合成。事实上，对C57BL/6小鼠连续两周口服LMWPH，可通过抑制制动引起的肌肉萎缩，并促进肌肉分化来提高总蛋白含量[10]。这些结果表明，LMWPH中所含的活性肽经消化吸收后到达靶细胞，并参与促进肌肉分化和抑制肌肉流失。本研究表明，由小分子量肽组成的LMWPH比WPC吸收更快，可能有助于抑制肌肉萎缩引起的肌肉流失。

在本研究中，LMWPH通过使用三种蛋白酶（Alcalase、Protamex和Flavourzyme）复合酶水解制备。酶处理改变了二级结构，降解了乳源性致敏原β-LG，并提高了WPC的热稳定性。LMWPH表现出比WPC更高的Caco-2细胞和肠道通透性，且对SD大鼠单次高剂量给药后迅速升高了血清蛋白浓度。综上所述，LMWPH具有较高的生物利用度，可作为有效的蛋白源应用于功能性材料和药品的开发。

免责声明

以上部分内容来源于外网我们重在信息分享，版权归属原作者或原刊发平台所有，如有侵权、信息有误或其他异议，请联系处理，我们将在24小时内删除或整改。