【咖啡知识】用万字论文一篇文章带你了解酵母发酵为什么会让咖啡风味变好 

前言

此文翻译自ScienceDirect中2022 LWT Volume 154, 15 January 2022, 112717的《Metabolomics and volatile fingerprint of yeast fermented robusta coffee: A value added coffee》。

酵母发酵（天然酿酒酵母发酵）虽然已经不算是咖啡行业热门话题，但从复杂的发酵方式到最近被行业内广泛谈论的增味咖啡（泛指处理过程复杂、风味具象、长时间难以变质的豆子），关于为什么增味咖啡的问题，我个人认为最主要的三点：

1、大部分农场的处理厂没有现代工厂的洁净度和认证

大部分处理，很难说明酵母（咖啡增味剂）是来自哪里，是天然的、可食用的还是有害的。农场处理不透明，因为商业机密不会全部公开。而且大部分农场都远离城市，这让溯源处理方法更为困难。农场的卫生水平一般。

2、破坏了市场完整性。因为咖啡豆外貌之间除了有一些微小的差别外。最重要的就是其风味变化了，风味决定了价格，也推动了精品咖啡行业的发展。

3、现在的有一些处理厂仿造高等级的咖啡豆风味，在加工初期添加剂，然后用低价的增味咖啡卖高价，打乱市场规则。消费者又很难辨别出精品豆和增味咖啡的区别，导致市场劣币驱逐良币。

此篇文章可以很明显看出。用罗布斯塔咖啡豆在水洗之后用发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) 之间从化学变化演变到成品中的风味区别，也可推测出发酵剂发酵的咖啡价格也会更高。也对应了我上面提到的这三点。

但我对处理复杂的咖啡还是抱有希望的，因为这也是推动咖啡文化（咖啡受众变多），对于消费者来说，新鲜的选择权更为重要，在下一个暴雷到来之后应该就会有相关的咖啡处理方法中的详细说明，可能会出新的咖啡配料表标准。

摘要

咖啡发酵是收获咖啡樱桃后，得到优质咖啡风味的关键。本文通过以酵母（酿酒酵母）作为发酵剂 (Y) 对罗布斯塔咖啡（CXR 品种）进行固态发酵，探索改良咖啡的特性。评估了 Y 以及自然发酵 (NF) 的微生物生态学、代谢、挥发性和感官特性。

粘液的主要成分为 43.3 Kcal/100g。Y populace (13 cfu log/g) 加速了发酵。Y发酵52小时，NF发酵60小时。生豆的水分含量为 12%，颜色、大小和形状均一。生物碱和绿原酸含量不显着。GC-MS 分析了 Y 生咖啡 (GC) 中的另外 10 种化合物，与 NF 相比，占总挥发物的 50.62%。醛类 (30.1%)、醇类 (13.8%)、脂肪酸 (10.7%) 和羧酸 (10%) 是 Y 发酵 GC 中的主要挥发物，其次是两组中的吡嗪和呋喃。Y 和 NF 挥发组学的主成分分析 (PCA) 表示 GC 和烘焙咖啡 (RC) 中 99.38% 的方差为 62.10%。Y 的感觉轮廓为 8，NF 为 6.5（范围为 0-10）。Y是风味调制和质量的决定因素。

关键词

罗布斯塔咖啡，发酵，酵母，挥发物，主成分分析

1 介绍

咖啡一种充满芳香并享誉全球的饮料，咖啡加工过程中的发酵是咖啡品质的先决条件。微生物群极大影响发酵中的咖啡风味和杯测质量。

咖啡粘液是由糖、果胶和蛋白质构成，易于在微生物群落的作用下发酵。咖啡中的微生物群因不同处理地区、咖啡果实的表面微生物区系和不同发酵过程而异。某些微生物生态学干扰咖啡发酵，从而产生独特的代谢物，为咖啡增添独特的风味。

发酵食品通常使用酵母作为发酵剂。在咖啡发酵过程中，酵母菌无处不在，它对于咖啡发酵、防止含氧丝状真菌生长、水解果胶以及通过分泌果胶分解酶降解粘液至关重要。挥发物、非挥发物和化学成分，如醛、酮、酸、碳水化合物、蛋白质、酚类化合物、脂肪酸和氨基酸，都会受到这些微生物酶活性的影响。

酵母作为发酵剂可以提高咖啡质量，并在阿拉比卡品种中形成高等级的感官风味。

在咖啡发酵和烘焙过程中形成的香气前体和风味的作用已得到广泛研究。阿拉比卡咖啡在大多数研究中都有体现，而罗布斯塔咖啡则相反。

最近，Harada报道了未发酵的罗布斯塔咖啡和开菲尔【1】混合的再发酵，以改善挥发性特征，因为罗布斯塔是一种低级咖啡。最近Wibowo、Mangunwardoyo、Santos等人研究了不同发酵持续时间对的利比里卡（Liberica）【2】咖啡豆感官品质的影响。

罗布斯塔咖啡豆的基因组成比阿拉比卡复杂。阿拉比卡发酵大约需要24-48小时，而罗布斯塔则需要48-72小时，具体时间取决于不可控的当地生态和气候条件。

延迟或延长发酵时间可能导致发酵不一致，另外导致感官属性中出现异味并且不可靠。研究强调在咖啡和可可发酵中使用发酵剂以获得更好的品质。

因此，在控制变量法下使用发酵剂（如酵母）有助于每次获得一致的发酵豆。印度是阿拉比卡咖啡和罗布斯塔咖啡种植面积排名前十的咖啡种植国之一，平均产量分别为 99000 和 235000 公吨。

罗布斯塔由于其不吸引人的品质而在市场中处于低级位置。在印度，除了这些品种外，种间 CXR 杂种（coffea congensis X coffea canephora）作为与父本C.canephora的混合种群进行栽培，因为该物种是一种有效的花粉供体，可提高产量且植株紧凑。

与其他罗布斯塔品种相比，它具有独特的香气和风味，在国际市场上获得了超过其价格的价值。这种咖啡主要用于烘焙制成咖啡产品。目前没有关于使用发酵剂培养 CXR 品种的水洗咖啡加工研究报告，希望这项研究能够带来新的质量维度。

因此，我们的目标是研究这种罗布斯塔品种，Coffea congensis x Coffea canephora (CxR) 与酵母发酵剂的发酵，以及它们对非挥发性、挥发性和感官特征的影响，这是有利于产品升值的处理的。

2 材料和方法

2.1 原料、化学品、微生物培养

咖啡果实罗布斯塔品种Coffea congensis × Coffea canephora (CXR) 于 2020 年1月至2021年1月从印度卡纳塔克邦切塔利的咖啡种植园中央咖啡研究站获得。化学品购自印度 Sigma-Aldrich。印度国家标准与技术研究院 (NIST) 被用作获取化学信息的标准参考。用于微生物技术的培养基购自印度Hi-Media。

根据我们早期对可可发酵的研究，设想使用酿酒酵母MTCC 173培养物并保存在印度中央食品研究与技术研究所。

在含有 200 ml 马铃薯葡萄糖肉汤 (PDB) 的 500 ml 锥形瓶中接种一圈再生的培养物，并在 28 ± 2 °C、100 rpm 下培养 48 小时。将该培养物转移到含有 5L PDB 的 10L 发酵罐中，并在 30°C 下孵育 24 小时，转子速度设置为 100 rpm。通过以 8000 rpm 离心 20 分钟收集培养物。用盐水洗涤沉淀并用作起始接种物。该有机体在马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 上恢复并生长，并在 4°C 下储存。

2.2 罗布斯塔咖啡发酵

收获成熟了的咖啡樱桃，分别去除过熟、未成熟、树枝等，用清水清洗咖啡樱桃并用商用咖啡制浆机制浆。

固态发酵 (SSF) 按照Siridevi等人所述方法进行，以通过自然发酵和酵母发酵剂培养去除咖啡粘液。SSF 使咖啡通过快速微生物活动将果胶物质和糖分排出到次生代谢物中。

在实验室规模的发酵桶中补充从指数生长期收获的酿酒酵母(Y)，接种量为 13 ± 0.5 Log CFU/g。自然发酵被称为不添加任何培养物的对照，发酵是由空气微生物群自发进行的。酵母处理 (Y) 和自然发酵 (NF) 以 50 kg 的批次大小进行，一式三份。

先将培养物接种到 Y 的预先标记的大桶中。每 4 小时将两个大桶间歇性混合，以便使用木耙进行适当的通气。

除了使用校准仪器记录发酵咖啡豆的 pH、温度和白利糖度外，每隔 8 小时收集一次样品。当用手揉搓没有粘液粘附时，发酵就完成了，然后是豆子上残留糖分的白利糖度指示。

完成发酵（Y 和 NF）后，将咖啡豆用清水预处理 10 小时，也称为水下浸泡，这样可以去除附着在咖啡豆上的残留果肉，同时提高豆子在颜色等方面的质量。

接着将水完全排出并将豆子均匀地铺在干燥网上晒干，直到水分为 10-12%。再用咖啡脱壳机去除外层/羊皮纸。使用咖啡烘焙机（型号：BRZ 6 型【3】，PROBATE-WERKE，德国）将去壳的生咖啡样品在 220 °C 下中度烘焙 8-12 分钟，然后磨成粉末以进一步分析。

BRZ 6

2.3 罗布斯塔咖啡粘液的近似组成

从新鲜制浆或未发酵的咖啡豆中分离出咖啡浆粘液，并使用 AOAC 方法测定近似成分。硝酸提取法用于评估果胶含量，纤维素根据Updegraff和 Gopalan 和 Rama Sastri估算碳水化合物和热量值。使用 pH 计（Control Dynamics，APX-175E/C，Bangalore，India）测量 pH。

2.4 微生物种群动态

在发酵过程中，咖啡豆每8小时无菌采集一次数据。计数采用平板法，PDA 用于酵母，MRS 用于乳酸菌(LAB)，PCA 用于完整微生物计数。

为了抑制酵母生长，将土霉素添加到 LAB 培养基中。PDA 板在 28 ± 2 °C 下保存 48 小时，而其他板在 37 °C 下孵育 24-48 小时，观察到的菌落数以 log10 cfu 中的菌落形成单位 (CFU) 数表示/g。

2.5 提取物的制备

通过将 100 ml 无菌蒸馏水添加到 100 g 咖啡豆块中提取发酵咖啡豆粘液 (FCM)，并使用 100 rpm 的摇床培养箱在 60 °C 下培养 30 分钟。提取物通过 0.45 μm 过滤器单元（Hi-Media，India）过滤。生咖啡豆、烘焙和磨碎的咖啡（100 克）用无菌蒸馏水（1000 毫升）在 40 °C 下使用摇床以 100 转/分的速度提取 30 分钟，并使用 0.45 微米过滤器单元（Hi-Media，印度）。因此，获得的滤液分别用于理化研究。

2.5.1 总糖、还原糖、多酚、蛋白质和有机酸

苯酚-硫酸法用于测定咖啡样品的总糖，稍作修改。加入 100 μl 样品、500 μl 5% 苯酚、150 μl 浓硫酸（H 2 SO 4），充分摇晃板 10 分钟，使用 Spark® 多模式酶标仪（Tecan Trading）测定吸光度AG，瑞士）在 490 nm。

通过使用葡萄糖标准绘制的标准曲线来完成样品的定量。还原糖的测定采用二硝基水杨酸法。

通过利用从不同浓度的葡萄糖标准（0.1-0.9 mg/ml）绘制的标准曲线获得样品的定量。加入样品（40μl）、水（80μl）、120μl二硝基水杨酸、40μl 40%罗谢尔盐溶液。将反应混合物在沸水浴中孵育 30 分钟，并使用 Spark® 多模式酶标仪（Tecan Trading AG，瑞士）测量 540 nm 处的吸光度。

咖啡样品提取物的总多酚通过 Folin-Ciocalteu (FC) 方法估计，如 Chen et al所述。将 20 μL 每个样品连续上样到 96 孔微孔板上，然后加入 100 μL Folin-Ciocalteu 试剂，充分混合并放置几分钟。之后，为了产生碱性反应，加入 80 μL 7.5% 碳酸钠溶液，并将板在 27 ± 2 °C 避光下孵育 1 小时。用分光光度酶标仪在λ 750 nm 处测量吸光度。使用食子酸作为标准，

从标准曲线对样品进行定量 (μg/ml)。咖啡样品提取物的蛋白质含量采用 Bradford 方法取 20 μl 样品，加入 200 μl Bradford 试剂，避光孵育 10 min，在 595 nm 处测定吸光度。使用相同的程序进行试剂空白（水）。使用不同浓度 (10–100 μg/ml) 的牛血清白蛋白绘制标准图。

根据Blake等人，使用具有四个泵和 UV 二极管阵列检测器的 HPLC 型号 LC-10A (Shimadzu) 对有机酸进行定量分析。进样 5 μl 样品，色谱分离采用 C18G 色谱柱（5 μm 粒径，4.6mm × 250 mm，日本）稍作修改。

该分析在λ max 是等度的：210 nm，使用新鲜制备的脱气流动相水和 0.005N 浓硫酸，流速为 1.0 ml/min，检测器灵敏度设置为 0.01 AUFS。用 HPLC 级水新鲜制备乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、奎尼酸和草酸的储备溶液 (1 mg/ml)。

将标准溶液稀释成 5 种不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8 和 1 mg/ml），并在 4°C 下保存备用。标准浓度绘制在校准曲线上。以 HPLC 级水为空白，对发酵青豆和烤豆样品的提取物进行分析。将提取物稀释 (1:5)，过滤（0.22 μ m 尼龙过滤器）并在最佳条件下一式三份注入 HPLC 系统。

2.5.2 通过超高效液相色谱 (UPLC) 分析绿原酸、咖啡因和葫芦巴碱

绿原酸、咖啡因和葫芦巴碱标准品的色谱分析以及所有提取的样品均按照 Pimpley 和 Murthy 进行分析。

在Acquity UPLC系统（沃特世公司，美国米尔福德）上使用来自Masherey-Nagel的50×2 mm Nucleodur C18极性1.8μm柱进行分析物的分离。色谱柱控制在 45 °C。

对于绿原酸的定量，(a) 0.1% 乙酸和 (b) 由乙腈/甲醇 (80:20, v/v) 和 0.1% 乙酸组成的二元混合物，流速为 0.4 ml/min。对于咖啡因和葫芦巴碱的定量，使用由乙腈/水 (20:80 v/v) 组成的流动相。

使用甲醇彻底清洗色谱柱和注射器以去除任何污染物。进样量为 5.0 μl，所有标准品、样品一式三份进样，峰面积用于定量评估。

使用水作为溶剂制备标准品（咖啡因、CGA 和葫芦巴碱）的储备溶液 (1 mg/ml)。将原液稀释至不同浓度并使用 0.25 μm 尼龙过滤器过滤。

2.6 发酵罗布斯塔生豆的物理分析

根据咖啡生豆标准，根据颜色、大小、水分和缺陷等不同参数确定发酵干燥生咖啡豆（NF 和 Y）的物理质量。所有测试均在每批随机选择的 300 颗咖啡豆上进行。

使用单个豆的可变豆直径（主要、次要和中等）确定平均豆体积。300 个豆样品的重量与体积之间的比率用于使用量筒测量平均豆密度。

采用 Konica Minolta CM5 (Tokyo, Japan) 分析咖啡豆的颜色，常规照明 D65 和 10° 的比色典型观察角度。计算 L、a 和 b* 并将其转换为色度 (c*) 和色相角 (b*) 值。

2.7 罗布斯塔咖啡挥发物

按照De Carvalho Neto 等人的建议，使用 PerkinElmer (Turbomass gold) 质谱仪 (IT-MS) 检测器 (美国，加利福尼亚州,瓦里安) 和 HS-40顶空进样器 (PerkinElmer, Norwalk, CT, USA) 对生咖啡和烘焙咖啡样品进行了色谱分析。

使用加热的熔融石英传输线将顶空 (HS) 进样器连接到使用分流不分流进样器的气相色谱仪。

色谱分离分析在熔融石英毛细管柱 TR-WAX-MS（Carbowax 30m × 25 mm × 25μ，Thermo Scientific，USA）上进行，进样器在不分流模式下运行 0.04 分钟。样品 (2g) 用于每次测定并储存在 20 ml HS 小瓶中。通过将小瓶加热至 70 °C 15 分钟，然后将纤维暴露15 分钟来提取香气挥发物。分析条件设定为进样口温度 240 °C 和压力 103 kPa，柱温设置为 40 °C 5 min，然后分别以 3 °C/min 至 180 °C 和 8 °C/min 至 240 °C 7 分钟。在全扫描模式下使用从 50 到 300 AMU 的质量范围来检测挥发性化合物。真实化合物的光谱和参考库（NIST 质谱库，2.0 版，Faircon Corporation 和美国）的光谱用于基于它们的质谱鉴定化合物。

2.8 感官概况

生咖啡样品在 220 °C 下中度烘焙（型号：BRZ 6 型，PROBATE-WERKE，德国）8-12 分钟，允许 8-24 小时，使用 5 号 Ditting （Ditting grinder No. 5）研磨机研磨（粒度稍粗） ; 70–75% 的颗粒通过美国标准尺寸 20 目）。

推测为 Ditting KR 804 Professional Coffee Grinder

用磨碎的咖啡和水（8.75 克，150 毫升，200°F（93°C），浸泡3-5 分钟，印度咖啡委员会质量评估中心中由训练有素的杯测师组成的小组，用于杯测的烘焙罗布斯塔咖啡冲泡，列出了潜在特征和参考资料以详细说明感官属性。咖啡样品按 1-10 的感受等级评分。

2.9 统计分析

这些试验在三个复制品种设计和执行，并以统计方法表示，考虑平均值的标准误差 (SE) 和标准偏差 (SD)。Microsoft Excel 程序（Microsoft Corporation，USA）用于所有统计计算。

获得的数据通过单变量方差分析 ( p* < 0.05)进行评估， 并使用邓肯的多范围检验 (DMRT) 来分离平均差异。对生咖啡和烘焙咖啡的化学代谢物进行非配对*t检验。

使用 XLSTAT 2014 插件软件对 Natural (NF) 和 Starter (Y) 挥发性代谢组学和感官属性的方差进行多变量分析，即主成分分析 (PCA)。

3 结果与讨论

咖啡的罗布斯塔咖啡粘液成分因地理、品种和物种而异。当前研究中使用的罗布斯塔咖啡樱桃是从生长在约2726英尺的罗布斯塔 (CXR) 咖啡树上收获的。

粘液pH值 (6.7–7)、成分为：水分（highly moist）(92–93%)、果胶 (7–8%)、蛋白质 (7–9%)、碳水化合物 (2.5–2.7%)、脂肪 (2.5–2.7) %）、纤维素（0.3-1.2%）、灰分（ash）（0.5-0.7%）和粗纤维（0.1%），热值为43.3 Kcal/100g[表1]。

粘液成分是主要来源或底物之一微生物的生长和释放次级代谢产物的活性。

表1 罗布斯塔咖啡粘液的近似成分

成分罗布斯塔粘液酸碱度6.7± 0.3b水分 ％92.0 ± 0.5 b蛋白质 ％6–8%总脂肪 ％2.5± 0.15b粗纤维 %BDL of 0.1总灰分 %0.5 ± 0.15 b果胶 %7–8纤维素%0.3–1.2碳水化合物差异 %2.5 ± 0.19 b热值 Kcal/100g %43.3

结果表示为平均值 ± SD (n = 3)，a 在P < 0.05 时显着 b 在P < 0.10 时显着

3.1 罗布斯塔咖啡固态发酵

咖啡采后加工包括受生态、生理、生化、微生物过程和内源性豆类代谢影响的多种重要活动。pH、温度和白利糖度（Brix）是描述发酵过程的少数可见标记[图1]。发酵时间为 52-60 小时，外部温度 (28 ± 0.5 °C)、相对湿度 (70-74%)、日长 (10-10.5 小时)、风 (10-13 km/h)、环境天然微生物群（酵母，好氧）和发酵剂（y）在调节发酵、代谢物产生和持续时间方面起着至关重要的作用。NF （酵母发酵）和 Y （自然发酵）的 pH 值持续下降；由于酵母的作用与粘液中的复杂有机物质降解成在 NF 中在第 12 小时比较简单的糖[图2]。缓解发酵 pH 值主要负责将复杂糖分解成更简单的糖，通过微生物活动释放酸。

图1 罗布斯塔咖啡与 a)自然发酵(NF)和 b)发酵剂发酵(Y)发酵指数参数，如时间、pH、白利糖度和温度

图2 罗布斯塔咖啡发酵过程的次级代谢物以及微生物负荷 发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF)

在 NF 和 Y (27–31 ± 2 °C) 中都观察到发酵物质的温度升高[图 1]。微生物生长释放热量，其酶活性导致温度升高。与 NF 相比，温度的快速升高表明 Y 样品中的发酵可行。在发酵结束时，发酵质量相对于总可溶性固体/白利糖度的下降在 NF 和 Y 中都持续下降[图1]。在 Y 样品中，与 NF（20 小时）相比，白利糖度从 8 小时迅速降低，表明糖的利用率。发酵剂培养物在52小时内完成发酵，而NF分别需要60小时。

3.2 罗布斯塔咖啡发酵和微生物计数

发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) 的样品中发酵豆粘液的周期性代谢组学特征[如图2所示]。初始 (0h) 总活细菌计数和[LAB]计数在 NF 中为 2.1 和 1.3 log CFU/ml，在 Y 中为 2.0 和 1.5。

Y 中的初始酵母计数（2.96 log cfu/ml）是 NF（1.64 log cfu/ml）的两倍。Y 中酵母数的显着增加（p < 0.05）为在早期（6-8 小时）Y 将复杂的碳水化合物（如蔗糖、果胶和纤维素）分解为更简单的单体（果糖/葡萄糖）提供了有利条件，并且比 NF的12-15 小时要快的多。

**发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) ** Y 在最初的 6-8 小时和 NF 的 12-15 小时内观察到复杂的碳水化合物（如蔗糖、果胶和纤维素）分解成更简单的单体（果糖/葡萄糖）。酵母的果胶分解活性及其抗逆能力为 Y 提供了比 NF 的优势。在 NF 中，在最初的 8 小时内，pH (6)、温度 (28 °C)、白利糖度 (8.5) 和酵母活性 (8.28 ± 0.15 log CFU/ml) 在分解多糖。

此外，在接下来的 8-16 小时发酵过程中，代谢物被转化为醇，从而促进了乳酸菌 (LAB) 的生长阶段。pH (3.7) 和白利糖度 (6.0) 的急剧下降说明 LAB (8.07 ± 0.05 log CFU/ml) 在单糖大量转化为乳酸中的作用，从而导致酵母菌群减少 (8.28–7.65 log CFU/ml) （图 2）。通过 pH 值为 3.5 和白利糖度 (4) 的醇产生酸来描述发酵过程的完成（图 1）。

在发酵剂 (Y) 发酵中，在前 8 小时内，白利糖度 (6.5) 显着下降，pH 值 (5.5) 显着下降，对应于代谢糖类 (蔗糖) 的酵母菌群 (8.97 ± 0.003 log CFU/ml) 急剧上升) 转化为单糖。乳酸菌群 (7.8 ± 0.03 log CFU/ml) 通过利用葡萄糖产生乳酸而缓慢发展。

在接下来的 16 小时内，白利糖度 (4.5) 和 pH 值 (4.0) 发生了重大变化，导致糖转化为醇和酸的效率低下（图 1），横向微生物群不足（7.6 ± 0.06）。在最后 8 小时内，温度 (30摄氏度)略有升高，pH (3.6) 和白利糖度 (3) 降低。酵母菌群从 8.9 减少到 7.3 log CFU/ml，而其他微生物群如芽孢杆菌、乳酸菌、明串珠菌和拟杆菌也显着减少（8.01-7.6 log CFU/ml），适当地将醇转化为有机酸，并彻底利用总可溶性固体（去除粘液）标志着发酵结束（图 1，图 2)。

3.3 生豆和烘焙 NF 和 Y 样品中的咖啡代谢物

精确代谢物的产生会引起风味的变化，以及具有丰富风味、香气的增强。 糖是发酵过程的主要标志物，是由微生物产生的。自然发酵 (NF) 的生豆的糖含量比发酵剂发酵(Y) 高 17%。在烘焙样品中，观察到 NF 和 Y 样品中的糖降解，75% 的糖保留在 Y 中，而 NF 中的糖含量为 61%，这在感官分析中是显而易见的（表2 )。

糖是最早用于咖啡发酵的代谢物，酵母是糖的主要作用者，在 Y 中糖的保留更多（表2）。在 NF 和 Y 的生豆和烘烤样品中观察到还原糖含量的变化不大（表2）。

还原糖在美拉德反应中起重要作用；许多报告已经揭示了生咖啡豆分离物的乙醇可溶性和不溶性部分，这些部分描述了还原糖在咖啡香气形成中的重要性。烘焙 NF 样品中还原糖的损失为 17%，而 Y 样品中仅为 5%，从而为基本风味前期的形成铺平了道路。

表2 NF 和 Y 绿色和烤罗布斯塔咖啡豆的化学成分

参数 （％）NF (G)Y（G）NF (R)Y（R）总糖19.40±0.04 c16.60 ± 0.17 d11.75 ± 0.06 a12.42 ± 0.35 a还原糖7.45 ± 0.06 c6.55 ± 0.03 b6.17±0.02 c6.24 ± 0.09 d总多酚5.52 ± 0.05 c5.04 ± 0.10 b2.97±0.01 c3.14 ± 0.02 d蛋白质14.72 ± 0.10 a15.79 ± 0.26 a7.84 ± 0.02 a7.40 ± 0.19 a总黄酮1.79 ± 0.12 a1.226 ± 0.16 a1.724 ± 0.15 a1.216 ± 0.14 a有机酸 (mg/g)



a) 柠檬酸3.91 ± 0.19 a4.26 ± 0.11 a2.56 ± 0.11 a2.90 ± 0.10 ab) 奎尼酸1.41± 0.20 a2.44 ± 0.23 a7.40 ± 0.27 a7.21 ± 0.28 ac) 苹果酸3.91 ± 0.15 a4.44 ± 0.095 a0.56 ± 0.15 a0.91 ± 0.07 ad) 草酸0.03±0.00 c0.05 ± 0.00 d0.02 ± 0.00 a0.01 ± 0.00 a咖啡因**(** %)2.14 ± 0.15 a1.85 ± 0.05 a1.84 ± 0.01 a1.83 ± 0.00 a绿原酸**(** %)3.71 ± 0.10 a3.57 ± 0.09 a1.51 ± 0.05 a1.66 ± 0.01 a葫芦巴碱**(** %)0.63 ± 0.01 a0.50 ± 0.02 a0.38 ± 0.01 a0.37 ± 0.01 a

发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) ，R = 咖啡熟豆，G = 咖啡生豆。结果表示为平均值 ± SD (n = 3)。没有相同小写字母的同一行中表示的平均值显着不同（P <0.05），未配对t检验。

在发酵的生咖啡中，Y 的多酚含量比 NF 减少 9%。但在烘烤样品中，多酚的损失几乎类似，但在 Y 中保留了 8% 以上（表 2）。Y 样品中 TPP 的较高保存是由于烘烤过程中结合酚类物质的释放。尽管变化很小，但 TP 的维持可以有助于提高营养功能。

绿原酸 (CGA) 是一种生物活性化合物，可改善人类健康，并增加咖啡的苦味。 酵母处理不影响 CGA 浓度，烘焙咖啡样品显示各组中 CGA 的损失（NF 和 Y 分别为 58% 和 54%）。

由于这些化合物是香气前体，因此，正如预测的那样，它们的浓度在烘烤后会降低。Macheiner等人描述了与C. arabica物种相比，C . canephora豆代表裂解反应后 3-CQA 和 4-CQA 异构体的较慢降解速率。

在生咖啡中，NF 的蛋白质含量低于 Y。但在烘焙样品中，Y 的降解率较高（表 2）。Y 中更大的蛋白质降解可能与烘烤过程中吡嗪的产生增加有关。

因此，通过 GC-MS 分析可以明显看出 Y 中较高的坚果味和杏仁味化合物。从与稠度相关的化学角度来看，低浓度的有机酸是咖啡中存在许多有利香味的原因。每种酸与咖啡中所揭示的味道的相关性是显着的。咖啡生豆中含量最多的有机酸是柠檬酸、奎尼酸和苹果酸。

在 Y 样品中，绿色和烘焙（8% 和 12%）中柠檬酸浓度的增加表明积极风味的增加，如酸味果味、浆果味和咖啡中产生的果味（表 2）。Vandenberghe 等人证实了我们的结果。

柠檬酸负责咖啡的明亮度，在烘焙过程中会慢慢分解。中度烘焙咖啡含有可辨别量级的柠檬酸，在烘焙过程中会损失约 50%，从而产生明显的酸度和确切的风味，而奎尼酸会导致苦涩味（有机酸的化学部分）。

在烘焙过程中，CGA 酸转化为奎尼酸，咖啡会影响感官特征。酵母处理并未影响奎宁的浓度和咖啡的苦味（表2）。苹果酸天然存在于咖啡中，提供均衡的酸味和果味（有机酸和咖啡化学)。

发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) 在 Y 样品中，与 NF 相比，其苹果酸浓度增加了 37%，并且具有增强感官的果味咖啡（表2）。草酸是一种存在于咖啡中的二羧酸，并导致酸味，Y 中草酸减少了20% ，有利于咖啡的最终质量，并在表2中列出，Borém等人也对此进行了详细阐述。

3.3.1 主要生物碱（咖啡因和葫芦巴碱）

咖啡因是一种天然存在的生物碱，属于甲基黄嘌呤家族。咖啡中的咖啡因因咖啡种类、烘焙技术和饮料制备而有显着差异。在绿豆样品中，NF 的咖啡因比 Y 高 14%。但在烘焙样品中，Y 中保留了 99% 的咖啡因含量，而 NF 中保留了 86%（表2），这可能是由于烘焙过程中的部分变化。

咖啡品种生长的海拔高度会显着影响咖啡因含量。烤豆中咖啡因的增加可归因于加工过程中水、二氧化碳和挥发性化合物等化学物质的损失。

葫芦巴碱在咖啡香气成分中起着至关重要的作用，其降解有助于形成吡咯和吡啶，从而产生令人愉悦的香气。在生咖啡中，NF 中葫芦巴碱的含量比 Y 高 21%（表 2）。在烘烤过程中， NF 比 Y 减少了40%的葫芦巴碱。

3.4 . 生咖啡的物理属性

咖啡豆的物理质量根据印度咖啡委员会的印度咖啡质量规范进行评估（Coffee Karma - A guide to indian coffee quality specification for green Coffee）NF 和 Y 豆分别为淡绿色，带有蓝色和绿蓝色，大小均匀，呈椭圆形/长方形，因为它是 congensis robusta 豆（表 3）。NF 和 Y 绿色 (72.5–75.8 Vx10 9 m 3 ) 的豆体积与 157.7–155.70Vx10 9 m 3烘焙的 NF 和 Y 类似. 豆和堆积密度是微不足道的。

烘焙由于热压的增加而增加了体积，并且由于NF和Y中挥发物的消失而使质量减少，从而提高了质量属性。NF (11.9 ± 0.5%) 和 Y (12 ± 0.2%) 的水分在罗布斯塔咖啡的可接受范围内。烤豆的颜色、膨胀率、传热率和烘烤损失都是微不足道的。豆类没有受到酵母应用的不利/不利影响，并列表2中，这是发酵和质量一个好的方面。

表3 NF 和 Y 绿色和烘焙罗布斯塔咖啡豆的物理质量

物理属性NF(G)NF(R)Y(G)Y(R)形状中等，椭圆形，均匀–中等，椭圆形，圆形–尺寸中等的-中等的-颜色绿色略带褐色棕色的绿色的棕色的水分12.7–12–体积 x 10 9 (m 3 )72.5 ± 2.5 b157.7 ± 3.5 b75.8 ± 2.7 b155.70 ± 4.1 b豆密度 (Kg m 3)1080± 60.2b710 ± 29.50 b1090 ± 70.3 b720 ± 35.20 b堆积密度 (Kg m 3)714 ± 21.25 b480±10.50 b724 ± 25.6 b454 ± 9.22 b烘烤时膨胀率(%)-60± 0.5b–62 ± 0.98 b传热率/烘烤率-高-高烘烤失重（%）-17±1.4 b-17% ± 1.5 b亮度（升）44.59 ± 0.98 b27.03 ± 0.99 b45.95 ± 0.97 b21.89 ± 0.95 b色度（一）3.21± 0.52b7.27 ± 0.48 b2.01 ± 0.16 b5.74 ± 0.30 b色相角 (b)21.1 ± 0.62 b10.76 ± 0.65 b20.81 ± 0.66 b7.33 ± 0.55 b

发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) ，R = 烘焙咖啡，G = 生咖啡 结果表示为平均值 ± SD (n = 3)。行内表示的重要性。a 在P < 0.05 时显着 b 在P < 0.10 时显着，ns 即使在P < 0.10 时也不显着。

3.5 罗布斯塔咖啡挥发物

3.5.1 生咖啡的挥发性成分

绿豆中的糖、蛋白质/氨基酸是饮料挥发组学的原因。 Y 和 NF 生咖啡分别感知到 26 和 16 种主要挥发性化合物，分别包括烷烃、呋喃、嘧啶、醛、酮、内酯、醇、脂肪酸、脂肪酸、羧酸、苯酚和其他碳氢化合物（图 3）。额外的 10 种化合物占 Starter (Y) 中检测到的总挥发物的 50.62%，使 GC 具有良好的气味属性。

脂肪酸 (45.1%)、酒精 (16.6%) 和脂肪酸 (9.9%) 是构成发酵剂 (Y) 发酵生咖啡的主要挥发物。NF 咖啡挥发物主要由醛（30.1%）、碳氢化合物（19.4%）和酒精（13.8%）贡献。生咖啡挥发物的主成分分析 (PCA) 占 Starter (Y) 和 Natural (NF) 的最大变异性 (PC1: 72.65%; PC2: 27.35%)，热图如图3c和乙。

volatiles 的 PCA 表示变量与 Starter (Y) 和 Natural (NF) 获得的独立因子的正相关或负相关，并在图3c 。结果表明，前两个主要成分可以解释 100% 的总变异性。主要变异由第一主成分 (PC1) 贡献，解释了 72.65%，而第二主成分 (PC2) 描述了总方差的 27.35%。生成的热图如图3b所示。

NF 促成了丁内酯、苯乙醇和乙酸等主要化合物，这些化合物赋予水果味、桃子味和草本味。而用 Y 处理对 2-壬烯醛、2,4-癸二烯醛、2,4-壬二烯醛、辛酸和顺式有贡献-1,2-二氢儿茶酚，赋予绿色的味道（联想）、黄瓜、醛、柑橘和油脂味，表明呈正相关。

1,3-二氧戊环-2-甲醇、1-庚烯-3-醇、苯甲醇、戊酸、己酸和庚酸等化合物存在于 NF 的相反象限中，表示负相关。同样，壬醛、十一醛、5-羟基嘧啶、苯甲醛、顺式-4,5-环氧-(E)-2-癸烯、乙偶姻、1-丁醇、3-甲基-、1-己醇、4-甲基-的浓度、乙酸、丁酸、3-甲基-、苯甲酸、2-羟基-、乙酯和苯酚在Y中比NF少，因此呈负相关。**发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) **

图 3 生咖啡挥发物分析 (a) 分组总 GC 峰面积的化学家族（左）及其在总面积中的贡献（右） (b) NF 和 Y Robusta 生咖啡中挥发物的相对强度，在热图中紫色代表较高的相对丰度而红色代表较低的相对丰度 (c) 含有挥发性化合物的生咖啡中 NF 和 Y 的得分图。

a-壬醛、b-十一醛、c-2-呋喃甲醇、d-5-羟基嘧啶、e-苯甲醛、f-2-壬醛、g-2,4-癸二醛、h-2,4-壬二烯醛、i- cis- 4,5-环氧-(E)-2-癸烯、j-乙偶姻、k-丁内酯、1-1-丁醇、3-甲基-、m-1,3-二氧戊环-2-甲醇、n-1-庚烯-3-醇，o-1-己醇，4-甲基，乙酸，对苯甲醇，q-苯乙醇，r-丁酸，3-甲基，s-辛酸，t-乙酸，u-苯甲酸，2-羟基-，乙酯，v-戊酸，w-己酸，x-庚酸，y-苯酚，z-亚硫酸，壬基2-丙酯，aa-三硅氧烷，1,1,1， 5,5,5-hexamethyl-3,3-bis[(trimethylsilyl)oxy]-,ab-Trimethyl(3,3-difluoro-2-propenyl)silane,ac-1,4-Pentadiene,3,3-dimethyl -, ad-cis-1,2-二氢儿茶酚。

3.5.2 烤咖啡豆挥发物

GC-MS 检测到 Y 和 NF 中的 39 种主要挥发性化合物，由吡嗪、吡啶、酮、酚、呋喃、内酯和其他烃类组成，Y 略有增加，从而对咖啡香气和味道产生积极影响（图4a )。

吡嗪是第二丰富的芳香族化合物，赋予咖啡中的烘焙风味、核桃、吐司样风味，并且 Y 含量略高。酮类容易产生由 Strecker 通过氨基反应降解而形成的果味、花香和蜂蜜味酸与二羰基化合物，可以归因于 Y 中的生咖啡，然后在烘焙样品中进行详细说明。令人着迷的是，Y 中的某些挥发物显着增加（p < 0.05），尤其是（13%）三种呋喃化合物（糠醛、2-呋喃甲醛、2-呋喃甲醇）赋予 NF 甜焦糖面包般的风味特征。

内酯（丁内酯）是 CGA 降解的产物，具有黄油/椰子味，并且在 Y 中比 NF 边缘。Starter (Y) 和 Natural (NF) 的烘焙咖啡 (PC1: 99.33%; PC2: 0.67%) 挥发物的主成分分析 (PCA) 以及由此生成的热图如图 4b 和c所示. 前两个主要成分可以解释 100% 的总变异性。主要变化由 PC1 贡献，解释了 99.38%，而 PC2 描述了总方差的 0.62%，其生成的热图如图4b所示

NF 含有乙酸（10.61% 面积）和丁内酯（1.53% 面积）作为主要化合物。烘烤导致苯乙醇的热降解。烘焙咖啡 (Y) 有助于产生吡嗪、甲基、2-丙酮、1-羟基、糠醛、2-丙酮、1-(乙酰氧基)-、2-呋喃甲醛、5-甲基-、2-呋喃甲醇和 2-甲氧基等化合物-4-乙烯基苯酚，具有坚果、甜味、焦糖、烘焙、樱桃和花生等风味，可增加咖啡的风味和香气。

图 4 烘焙咖啡挥发物分析 (a) 分组总 GC 峰面积的化学家族（左）及其在总面积中的贡献（右），(b) NF 和 Y 罗布斯塔烘焙咖啡中挥发物的相对强度，在热图中紫色代表较高的相对强度丰度，而红色代表较低的相对丰度，（c）含有挥发性化合物的烘焙咖啡中 NF 和 Y 的得分图。

3.6 感官分析

发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) 样品由合格的品尝小组在杯测量表上对感官进行评分，表明风味特征包括香气（Aroma）、香味（Fragrance）、盐（Salt）、酸（Acid）、Body、甜味（Sweentness）、苦味（Bitterness）、入口感（Mouth）、回味（After taste）、平衡（Balance）、干净度（Clean cup）、均匀（Uniform）和一致（Consisent）的杯测。NF (6.5) 和 Y (8.0) 与指定的感官评分相比有 20.68% 的显着差异。PCA 与 GC-MS 数据和感官评分 PC1 91.97 和 PC2 8.03 相关（图 5 ），除了双标图表明像涩味和烧焦这样的负面风味与 Y 样品中的感官评分和这些风味的减少呈负相关。

因此，获得的结果肯定了 Y 和 NF 的挥发性和味道特征。图 6描绘了 NF 和 Y 咖啡冲泡的感官属性。此处 PCA 的实施将 GC-MS 数据与代表总方差的 100% 的感觉分数相关联，其中 PC1 和 PC2 分别表示 91.97% 和 8.03% 的方差（图 5）。

NF 咖啡冲泡的 GC 曲线赋予化合物，这些化合物负责产生丰富、烘烤、苦味和酸性回味等味道，这些回味可能与绿原酸和咖啡因的存在有关。带有启动器 (Y) 的控件 (NF) 显示在热图中（图 6 ）。

发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) 的嗅觉描述增加了对烘焙和冲泡咖啡中香气活性分子感知和理解。Y 咖啡冲泡风味明显并且优质，如巧克力、舒适、甜味、果味、黄油味、焦糖味、花香、坚果味和草本味这些结果表明，使用酵母培养物发酵咖啡的总体可接受性更高。此外，在 NF 中保留了不希望的焦香、木质、清淡和涩味。

图 5 NF 和 Y 烘焙咖啡的感官属性得分图。

图 6 描绘 NF 和 Y 咖啡冲泡的感官属性的热图。红色代表较高的感官评分，而绿色代表较低的感官评分。

4 结论

合适的酵母发酵剂培养物，在咖啡发酵过程对产生强烈的香气起着至关重要的作用。 水洗加工处理的罗布斯塔咖啡 (CXR) 在咖啡粘液和发酵豆的降解过程中引入了由天然微生物活动产生的芳香物质/成分。发酵剂发酵 (Y) 自然发酵 (NF) 中 Y 的动态作用对罗布斯塔咖啡产生了深远的影响，其特征在于发酵过程中分泌的初级和次级代谢物。与 NF 相比，Y 中挥发物和非挥发物的平衡改善了烘焙咖啡的感官特性。通过使用发酵剂Y可以增强风味并增加产品的附加值。

【1】开菲尔又称为牛奶酒、鹹酸奶，是发源于高加索的发酵牛奶饮料。

【2】大果咖啡（学名：Coffea liberica）又名赖比瑞亚咖啡、利比里卡咖啡，亦称赖比瑞亚种（Liberica），是一种抗虫害、适合高温潮湿气候的品种，其浆果和种子都要比小果咖啡大到近两倍，香味浓郁，但风味很淡，一般北欧人比较喜欢这种咖啡。主要在西非例如：非洲赖比瑞亚、象牙海岸、马达加斯加。

利比里卡咖啡树

【3】BRZ 样品烘焙机是 PROBAT 鼓式烘焙机中最小的一款。然而，带有旋风分离器的电池样品烘焙机 (BRZ) 的传统烘焙滚筒是旋转安装的，手柄连接在背面，用于将物料倒入位于前面的冷却筛中。RZ 配备燃气燃烧器或电加热装置，均安装在滚筒下方。

BRZ 特别适用于生豆质量分级，从而在质量控制和生产开发过程中提供支持。有每桶 100 克批量容量的两桶、四桶或六桶版本简称为：Probat BRZ 2/4/6

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