激光共聚焦显微镜 TruFocus 自动对焦如何使用？

Evident FV4000 的 TruFocus Red 自动对焦可补偿 Z 轴焦点漂移，介绍单次 AF、连续锁焦、焦点搜索三种模式操作流程、参数设置与常见问题，助力活细胞长时间延时成像。

在活细胞长时间延时、多位置多点成像、三维 Z‑stack 堆栈采集实验中，焦点漂移是很多科研人员经常遇到的棘手难题。实验室环境温度波动、孵育舱温度变化、培养液蒸发、添加药物试剂、载物台移动，都会引发微米级别的 Z 轴偏移。短时间成像或许影响有限，但当实验时长拉长到数小时甚至几十小时之后，焦面会持续偏移，原本清晰的亚细胞结构逐步虚化，最终出现整组图像失焦报废，前期样品制备、探针标记、设备调试的大量时间成本白白消耗。Evident FV4000 激光共聚焦显微镜搭载升级后的 TruFocus Red Z 轴漂移补偿自动对焦系统，依靠低光毒性近红外检测激光识别盖玻片与培养液的界面，实时监测并且修正 Z 轴位置，解决长时间成像焦点漂移痛点。很多用户硬件安装完成后，对于 TruFocus 不同工作模式、参数设置、适配物镜、样品适配场景、避坑要点并不熟悉，只有掌握正确使用流程，才能充分发挥这套自动对焦硬件的全部性能，保障 XYZT 四维时序、大视野拼接、多孔板筛选类实验的数据可靠性。

TruFocus Red 自动对焦的核心原理，是采用独立近红外检测光源，不会干扰样品荧光信号采集，也不会对活细胞产生额外光损伤。系统并不会直接识别细胞荧光结构，而是定位培养容器的界面反射信号，再通过设置 Z 轴偏移量，换算得到样品细胞所在的焦平面位置。这套升级版本兼容 X Line、A Line 全系列物镜，干镜、油浸物镜、硅油物镜均可适配，玻璃底培养皿、塑料培养板、共聚焦专用盖玻片都支持检测。需要区分的是，TruFocus 不会替代人为粗调对焦，它是漂移补偿工具，需要用户预先完成基础对焦，再启用自动对焦功能。在 cellSens 软件内部集成整套控制模块，无需外接第三方控制器，软件界面、硬件控制面板都可以切换工作模式，主要分为**单次自动对焦、连续锁焦模式、焦点搜索模式**三种核心工作模式，不同实验场景要匹配对应的模式。

单次自动对焦模式，也叫位置专属 AF 模式，多用于多点多位置延时成像、多孔板成像、大视野拼接扫描、多视野 Z 堆栈采集。很多实验需要同时记录十几个不同 XY 点位，各个点位的盖玻片平整度存在微小差异，每移动到一个新视野，焦面就会发生偏移。使用单次自动对焦的标准操作流程，首先放入样品，选择对应物镜，完成预扫描，手动找到第一个成像位点，调整图像至清晰状态，设置合适的 Z 轴偏移数值，这个偏移代表盖玻片界面到目标成像层面的距离。随后在多区域延时 MATL 模块里面登记各个 XY 位置，勾选每个点位启用单次 AF。载物台移动到新位置之后，系统执行一次界面识别，自动修正 Z 轴高度，完成本次点位采集，随后移动至下一个位置。

该模式下，每一个登记的位置都会独立执行一次对焦校正，不会沿用前一个视野的 Z 坐标，有效抵消培养皿平整度带来的误差。典型应用包含多孔药物筛选、类器官多点观测、脑组织切片大视野拼接。使用时注意，单次对焦仅在切换点位瞬间执行校正，点位采集过程中不会持续修正漂移，如果单一个位点成像时间很长，单纯依靠单次 AF 就不足以抵消温度带来的缓慢漂移，这种场景就要切换至连续锁焦模式。

连续锁焦模式是活细胞长时程延时成像最常用的模式，适合线粒体动态、细胞迁移、细胞球三维长时间记录、细胞周期追踪这类需要数小时到数十小时持续观测的实验。开启连续锁焦后，TruFocus Red 会持续监测样品容器界面，实时反馈 Z 轴位置，只要发生微小漂移就立刻驱动 Z 轴进行补偿修正，全程锁定焦面。操作步骤上，放置活细胞样品，设置好孵育舱温度，等待舱内温度充分稳定，减少开机初期温度剧烈波动带来的干扰。手动完成对焦，调试 Z 轴偏移参数，确认成像画面达到理想清晰度，在软件开启连续锁焦，再启动 XYZT 延时序列采集。

在 FV4000 平台上，连续锁焦可以和 1K 共振扫描、SilVIR 高灵敏度探测器、TruAI 降噪、TruSight 反卷积完整协同工作。共振扫描实现高速低光毒成像，TruFocus 守住焦点不跑焦，TruAI 改善高速扫描带来的信噪比下降，整套软硬件配合，能够完成十几小时甚至 48 小时的活细胞三维时序记录。这里有一个关键实操要点：连续锁焦运行期间，不要手动转动 Z 轴旋钮，人为干预 Z 轴会打乱锁焦基准，造成整体焦面偏移。如果需要更改成像层面，先暂停连续锁焦，调整完成之后再重新开启锁焦。

焦点搜索模式主要用于样品找不到界面、偏移参数不确定的场景。当更换全新样品、更换不同类型培养皿、切换不同浸液物镜，不清楚 Z 轴偏移该填多少数值时，可以调用焦点搜索。设置合理的 Z 轴搜索范围，系统会在设定区间内扫描，自动识别容器反射界面，给出基准位置，用户基于搜索结果再微调偏移，快速完成初始对焦设置，降低新手设置门槛。尤其硅油物镜用于厚组织、类器官成像，界面位置不容易直接判断，焦点搜索模式可以大幅缩短参数调试时间。

除模式选择之外，Z 轴偏移参数是 TruFocus 使用当中最容易出错的关键点。偏移代表 “盖玻片界面” 到 “想要拍摄的细胞层面” 之间的距离。比如贴壁细胞贴在盖玻片上，偏移数值就设置很小；如果要观测细胞球内部深层位置，则需要增大偏移值。偏移设置错误，即便自动对焦提示对焦成功，实际细胞层面依然会模糊。油镜、硅油物镜更换后，折射率发生变化，必须重新校准 Z 轴偏移，不能直接沿用干镜的参数，否则补偿位置会出现系统性偏差。

同时还要区分不同样品容器适配条件。玻璃底共聚焦培养皿反射信号强，识别稳定；普通塑料培养皿部分波段反射弱，要确认物镜与 TruFocus Red 的兼容性；厚切片石蜡样本没有培养液‑盖玻片界面，这类固定样本不适合依靠 TruFocus 做自动找焦，仅活细胞培养体系可以发挥最大效果。物镜方面，硅油物镜用于长时间活细胞延时成像具备优势，硅油 37 摄氏度不会干涸，搭配 TruFocus 连续锁焦，非常适合类器官、细胞球长时间三维成像。

在实际实验流程上，给大家整理一套 FV4000 使用 TruFocus 完整实操顺序。第一，装载样品，安装目标物镜，开启孵育舱，等待温度稳定，建议孵育舱预热至少三十分钟，避免开机温度剧烈漂移；第二，粗调、细调手动对焦，预览荧光图像，找到目标成像区域；第三，调用焦点搜索，识别盖玻片界面，根据成像深度设置 Z 轴偏移，预览荧光图像确认细胞成像清晰；第四，根据实验类型选择对应对焦模式：多点多位置选单次自动对焦，长时间单位点活细胞延时选连续锁焦；第五，配置扫描参数、Z‑stack 范围、时间间隔，预览一轮完整采集流程，确认自动对焦执行正常；第六，正式启动延时实验。

同时需要了解常见故障排查，很多用户遇到 “TruFocus 提示对焦失败”，大多来自几类原因：培养皿底部污渍、划痕、残留培养基会干扰界面反射信号，需要更换干净培养容器；浸液物镜油滴过少、出现气泡，造成反射异常；Z 轴搜索范围设置过小，无法扫描到界面位置；偏移设置过大，目标成像区域已经超出物镜工作距离。遇到对焦失败，优先检查培养皿底部和浸液状态，重新运行焦点搜索，不要盲目直接启动长时间实验，避免通宵实验全部失焦。

Evident原奥林巴斯显微镜：https://www.evidentscientific.com.cn/zh/

激光共聚焦显微镜-fv4000：https://lifescience.evidentscientific.com.cn/zh/laser-scanning/fv4000/