同为乳清蛋白水解物，效果差距有多大？这项研究揭晓答案！

骨骼肌是人体最大的器官，约占体重的40%。它不只会“动”，还在默默做着支撑身体、调节代谢的重要工作。

而肌肉的健康，取决于两股力量的博弈：合成与分解。年轻时，合成占优，肌肉量稳步积累；但随着年龄增长、活动减少，天平逐渐倾斜——分解超过合成，肌肉便开始流失。当这种流失持续加剧，就进入了医学定义的肌肉减少症，不仅影响日常活动能力，还与代谢疾病风险、生活质量和死亡率密切相关。

补充优质蛋白，是干预这一过程的关键一环。在众多蛋白质来源中，乳清蛋白的营养价值公认最高，必需氨基酸和支链氨基酸含量均领先于植物蛋白和大多数动物蛋白。近年来，乳清蛋白水解物因其吸收快、利用率高的特点受到越来越多的关注。但不同水解工艺得到的产品，效果是否一样？哪一种更优？

一项最新发表于动物实验研究给出了答案：研究人员将乳清蛋白水解物分为不同种类，对比它们在肌肉萎缩模型中的干预效果，最终筛选出一种可溶性乳清蛋白水解物（WP-S） ，在提升握力、增加肌肉重量和肌纤维横截面积方面均表现最佳。

进一步机制研究发现，WP-S通过激活PI3K/Akt/mTOR通路（促进肌肉蛋白质合成），同时抑制PI3K/Akt/FoxO通路（减少肌肉蛋白质降解），实现了“双向调节”——不仅帮助身体“盖肌肉”，还防止身体“拆肌肉”。这不仅为改善肌肉流失提供了新的营养思路，也为肌少症的相关研究打开了新方向。

可溶性乳清蛋白水解物通过调节PI3K/Akt通路改善C57BL/6小鼠制动诱导的肌肉萎缩

摘要：

肌肉减少症（sarcopenia）是指骨骼肌质量和功能的丧失，在老年人群中普遍存在，并与功能衰退和死亡率升高相关。补充蛋白质对于维持骨骼肌质量十分必要，而乳清蛋白水解物在食物蛋白质中具有最佳的营养品质。本研究第一项实验：对C57BL/6小鼠进行为期1周的制动处理以诱导肌肉萎缩。随后，在持续制动条件下，分别给予小鼠四种不同的乳清蛋白水解物，持续2周。结果显示，可溶性乳清蛋白水解物（WP-S）在握力、肌肉重量和肌纤维横截面积方面的效果最为显著，优于其他乳清蛋白水解物。为探究其分子机制，我们采用相同的实验设计开展了另一项实验。结果表明，WP-S显著激活了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，同时抑制了PI3K/Akt/叉头框蛋白O（FoxO）通路。此外，WP-S还提高了比目鱼肌和股四头肌中肌球蛋白重链（MyHC）的表达水平，并改变了MyHC亚型的表达。综上所述，WP-S通过增强调控肌肉蛋白质合成与降解的净蛋白质含量，进而缓解减轻了制动所诱导的肌肉萎缩。因此，WP-S是开发预防肌少症功能性食品的一个必要且可行的候选原料。

引言：

骨骼肌是人体最大的器官，约占总体重的40%，并在体内承担着多项重要功能。它使人体能够运动、支撑骨骼与器官，并调节葡萄糖稳态[1]。因此，肌肉质量的流失不仅会造成日常生活不便，还会进一步加重其他代谢性疾病[2]。骨骼肌质量受肌肉蛋白质合成（MPS）与肌肉蛋白质降解（MPD）之间平衡的调控[3]。当这一平衡被打破（MPS < MPD）时，就会出现肌肉质量的流失，进而导致肌肉萎缩[4]。肌肉萎缩和肌力下降的持续状态，现被定义为肌肉减少症（sarcopenia）。肌少症在老年人群中普遍存在，与健康及功能衰退、疾病与损伤、生活质量乃至死亡率密切相关。

老年人的蛋白质摄入量往往低于年轻人。近期一项研究表明，约10%至30%的居家老年人未能达到每日蛋白质摄入的估计平均需求量（0.7 g/kg/day），而这一摄入量对于维持骨骼肌质量是必需的[5]。在各类食物蛋白质中，乳清蛋白具有良好的营养价值，与植物源性和动物源性蛋白质来源相比，乳清蛋白的氨基酸含量最高（包括必需氨基酸和支链氨基酸（BCAA））[6,7]。

乳清蛋白是一种从奶酪生产副产物中分离出来的蛋白质混合物。乳清可分为两种类型：甜乳清与酸乳清。甜乳清是使用凝乳酶凝固奶酪生产过程中产生的副产物。由于大多数奶酪均采用凝乳酶制作，所以甜乳清通常被称为乳清。酸乳清则是通过酸凝固奶酪生产过程中产生的副产物。乳清蛋白含有乳铁蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、糖巨肽以及免疫球蛋白[8]。乳清蛋白是肌肉代谢的重要营养素，因其能提高肌肉蛋白质合成速率，同时降低肌肉蛋白质降解速率[7,9,10]。乳清蛋白水解物是乳清蛋白的水解形式，可被快速吸收并消化为游离氨基酸进入血浆，从而促进骨骼肌蛋白质合成。Morifuji等人研究表明，摄入乳清蛋白水解物比摄入等量完整乳清蛋白更能提高血浆氨基酸浓度[11]。此外，乳清蛋白和乳清蛋白水解物均富含支链氨基酸（BCAA）。多项研究表明，支链氨基酸（尤其是亮氨酸）可通过激活mTOR通路来刺激肌肉蛋白质合成（MPS）[12-14]。

肌肉蛋白质合成主要由PI3K/Akt信号通路调控[15-17]。当胰岛素或胰岛素样生长因子1（IGF-1）分泌并结合到肌肉中的相应受体时，会磷酸化胰岛素受体底物1，进而激活PI3K。PI3K将细胞膜上的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸，促进Akt的黏附并使其磷酸化。Akt激活以mTOR复合物1（mTORC1）形式存在的mTOR。mTORC1通过真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白S6激酶β-1（S6K1）等底物的磷酸化来调控翻译过程。S6K1和4E-BP1分别通过激活核糖体蛋白S6和释放翻译起始因子eIF4E来促进肌肉蛋白质合成。此外，Akt还通过磷酸化作用抑制FoxO（一种萎缩基因的转录因子），导致FoxO从细胞核转位至细胞质[18]。

肌肉蛋白质降解主要受泛素-蛋白酶体系统和自噬体-溶酶体系统调控。FoxO通过调控多种肌萎缩相关基因的表达来调控这两种肌肉蛋白质降解系统[19]。两种肌肉特异性E3泛素连接酶——肌肉萎缩F-box蛋白（Atrogin-1）和肌肉环指蛋白-1（MuRF1），已被广泛用作多种肌肉萎缩模型中泛素-蛋白酶体系统活性的标志物[20,21]。自噬的具体作用机制尚不明确，但一项研究发现，BCL2/腺病毒E1B 19 kDa蛋白相互作用蛋白3（Bnip3）的过表达能够诱导自噬，而在体内实验中，敲低Bnip3会抑制FoxO3诱导的体内自噬[22]。

肌肉蛋白的合成与降解均对营养、运动、激素及疾病状态等刺激因素敏感[23]。目前已有多种策略被证实可用于减轻肌肉萎缩，如蛋白质补充、抗阻或耐力运动，以及抗氧化/抗炎化合物[24]。其中，我们重点关注蛋白质补充的作用，尤其是乳清蛋白水解物。尽管乳清蛋白水解物对肌肉的合成代谢效应已被广泛研究[25-27]，但目前尚无研究比较不同水解条件以筛选最佳水解产物，也未探究其在肌肉萎缩状态下的干预效果。本研究将乳清蛋白浓缩物或酸乳清水解为四种不同的乳清蛋白水解物，并比较了它们对肌肉萎缩的影响。根据实验结果，我们筛选出对抗肌肉萎缩最有效的乳清蛋白水解物。随后，我们使用所选样品以三种剂量进行了另一项实验，旨在确定临床试验中的最佳使用剂量，并探究其分子机制。

结果

1.四种不同乳清蛋白水解物（AW-H、AW-S、WP-H 和 WP-S）在制动诱导肌肉萎缩模型中的比较

与IM组（制动模型组）相比（AW-S组除外），总蛋白质摄入量未见显著差异，因此可推断后续实验结果是由四种不同乳清蛋白水解物本身的施用所引起的（补充图S3）。实验结束后，各组间体重无显著差异（补充图S4）。一周的固定处理可显著降低握力，并显示了制动诱导肌肉萎缩的发生。实验结束时，IM组的握力较正常组下降了26.2%，而WP-S组的握力则显著增加了14.7%（图1A）。

图1. 四种不同乳清蛋白水解物（AW-H、AW-S、WP-H 和 WP-S）在制动诱导的肌肉萎缩模型中的应用比较。

补充图S3.总摄食量与总蛋白质摄入量。

补充图S4.体重。

动物处死后，分离三种不同的骨骼肌组织（快缩肌：股四头肌、腓肠肌；慢缩肌：比目鱼肌）。与正常组相比，IM组骨骼肌（股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌）的肌肉质量分别显著降低了19.7%、18.2%和33.2%；而与IM组相比，WP-S组分别显著增加了7.8%、4.7%、32.0%（图1B-1D）。与正常组相比，IM组腓肠肌总蛋白含量显著降低了22%；而与IM组相比，WP-S组该蛋白含量显著增加了21%（图1E）。组织学分析通过测量每条肌纤维的横截面积（CSA）进行（代表性图片见补充图S5）。在图1F中，IM组每条纤维的CSA分布减小。此外，乳清蛋白水解物处理使每条纤维的CSA分布增大（WP-H = AW-S < AW-H < WP-S）。此外，IM组的平均CSA比正常组低50.6%；AW-H组显著增加了25.6%，WP-S组显著增加了29.5%（图1G）。

补充图S5：腓肠肌组织切片的H&E染色代表性图像

2. 四种不同乳清蛋白水解物对肌肉蛋白质合成与降解效果的比较

本研究检测了参与肌肉蛋白质合成与降解的相关蛋白，测定了作为肌肉蛋白质合成标志物的4E-BP1和S6K1的磷酸化比率。与正常组相比，IM组中4E-BP1的磷酸化比率显著下降，而在WP-S组则显著升高。与正常组相比，IM组中S6K1的磷酸化比率显著降低，而与IM组相比，在AW-H和WP-S组均显著升高（图2A）。肌肉蛋白质降解标志物Atrogin-1和MuRF1的蛋白表达水平在IM组中较正常组显著升高，而WP-S处理后这些升高则显著降低（图2B）。

图2.四种不同乳清蛋白水解物对肌肉蛋白合成和降解效果的比较。

3.WP-S增加握力、肌肉质量及肌纤维的横截面积

我们采用与3.1节相同的实验设计，开展了另一项研究以探究WP-S的分子作用机制，并对小鼠给予三种剂量的WP-S（400、800和1200 mg/kg）。

WP-S处理组的总蛋白质摄入量与IM组相比无显著差异（补充图S3）。与正常组相比，IM组及WP-S处理组的体重显著降低了约7%（补充图S4）。实验结束时，IM组的握力较正常组显著降低31.9%，而WP-S 1200组的握力较IM组显著增加14.6%（图3A）。

图3. 可溶性乳清蛋白水解物（WP-S）在制动诱导的肌肉萎缩模型中的作用。

与正常组相比，IM组的肌肉重量（股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌）分别显著降低了24.1%、33.3%和53.9%。WP-S 1200组的股四头肌重量较IM组显著增加了12.8%；WP-S 800组与WP-S 1200组的腓肠肌重量较IM组分别显著增加了15.8%和16.3%；WP-S 400组、WP-S 800组及WP-S 1200组的比目鱼肌重量较IM组分别显著增加了26.6%、26.1%和41.6%（图3B-D）。与正常组相比，IM组的腓肠肌总蛋白含量显著降低了29%；与IM组相比，WP-S 800组和1200组分别显著增加了23%和27%（图3E）。

组织学分析显示，IM可降低各肌纤维的横截面积（CSA），而WP-S处理则以剂量依赖性方式增加了横截面积（图3F）。分布图显示，IM降低了各肌纤维的整体横截面积，而WP-S处理则以剂量依赖性方式使其增大（图3G）。与正常组相比，IM组的平均CSA显著降低56.6%；而WP-S 800组和WP-S 1200组的平均CSA较IM组分别显著增加27.6%和64.8%（图3H）。IM组的平均横截面积较正常组显著降低了56.6%，而WP-S 800和1200组比IM组分别显著增加了27.6%和64.8%（图3H）。

4. WP-S恢复肌肉蛋白质合成与降解之间的平衡

我们研究了WP-S对PI3K/Akt通路的影响，该通路已知可调控肌肉蛋白质合成。在IM组中，PI3K的磷酸化比率显著降低，随后Akt、mTOR、4E-BP1和S6K1的磷酸化比率也出现显著下降。WP-S给药以剂量依赖性方式缓解了由IM所诱导的上述下降现象；且在WP-S 1200组中，其恢复至正常水平（图4A）。

图4.可溶性乳清蛋白水解物对肌肉蛋白质合成和降解的影响。

我们检测了转录因子FoxO3a的表达，该转录因子可调控 Atrogin-1、MuRF1以及Bnip3的表达水平，并检测了Atrogin-1、MurF1和Bnip3的蛋白及基因表达水平。在IM组中，FoxO3a的磷酸化比率显著降低；WP-S给药以剂量依赖性方式显著提高了该比率。当FoxO3a发生磷酸化时，会转位至细胞质并被降解，因此，Atrogin-1、Murf1及Bnip3的表达水平随之下降。这一假设在蛋白和基因表达水平上均得到验证。在IM组中，Atrogin-1、Murf1及Bnip3的蛋白表达水平均显著降低，而WP-S处理以剂量依赖性方式使其升高（图4B）。此外，IM组中atrogin-1、murf1和bnip3的基因表达水平也显著降低，WP-S处理组则以剂量依赖性方式使其升高（图4C）。

5. WP-S对总肌球蛋白重链及其亚型表达的影响

为探究两种不同肌肉类型中肌球蛋白重链（MyHC）的变化，采用qRTPCR技术分析股四头肌与比目鱼肌中的mRNA水平。结果显示，IM组中两种肌组织的总MyHC表达均显著降低，而WP-S给药则以剂量依赖性使其升高（图5A、B）。在快缩肌的股四头肌中，MyHC IIx和IIb占MyHC亚型表达的大部分[36]。在IM组中，MyHC IIa与IIx的表达水平显著降低，而MyHC IIb的表达水平则显著升高。鉴于IM组中总MyHC表达显著降低，这表明IM诱导的MyHC表达水平下降更可能影响慢型MyHC亚型而非IIb亚型。这些变化通过WP-S给药以剂量依赖性方式得到恢复（图5A）。

图5.可溶性乳清蛋白水解物对肌球蛋白重链（MyHC）表达的影响。

另一方面，在比目鱼肌（慢缩肌）中，MyHC I占MyHC亚型表达的大部分[36]。在IM组中，MyHC I的表达水平显著下调，而MyHC IIa和IIx的表达水平则显著上调。这些变化趋势经WP-S处理后呈剂量依赖性方式得到逆转（图5B）。

讨论

肌少症可由肌肉活动不足（后肢卸载、制动、石膏固定）、神经损伤（去神经支配）、疾病（糖尿病、恶病质、肥胖症）或衰老所致[3,24,37]。已知肌少症主要与衰老相关，但其与体力活动减少亦存在密切关联[38,39]。目前，肌少症的体内模型包括老年小鼠、衰老加速小鼠P8（SAMP8）、后肢卸载模型及制动模型[40]。本研究采用后肢制动模型，来诱导由持续性肌肉失用引起的肌肉萎缩。

在第一项研究中，我们将乳清蛋白浓缩物或酸乳清水解为四种不同的乳清蛋白水解物（AW-H、AW-S、WP-H 和 WP-S），并比较了它们对肌肉萎缩的影响。我们测量了握力、肌肉重量、横截面积（CSA）以及肌肉蛋白质合成和降解标志物的表达。结果显示，相较于其他乳清蛋白水解物（AW-H、AW-S、WP-H），WP-S可更显著改善因制动作用下降的肌肉功能与肌肉质量（图1）。根据氨基酸组成分析结果（表1），这可能是因为WP-S的总支链氨基酸含量高于其他乳清蛋白水解物。值得注意的是，WP-S的亮氨酸含量低于AW-H与AW-S，但其总支链氨基酸含量却高于AW-H和AW-S。鉴于亮氨酸被广泛认为是支链氨基酸中最能有效促进肌肉蛋白质合成的组分[41,42]，我们的研究结果表明，在增加骨骼肌质量方面，总支链氨基酸含量比亮氨酸含量更为重要。然而，除支链氨基酸外，WP-S中可能还含有其他对肌肉萎缩具有缓解作用的活性成分。迄今为止，关于乳清蛋白水解物的成分是否能刺激肌肉蛋白质合成、抑制肌肉蛋白质降解，相关研究仍较为匮乏。因此，我们目前正在通过开展体外实验来探究WP-S中的活性成分。

近期研究表明，制动状态会显著降低肌肉力量、肌肉质量以及肌纤维横截面积（CSA）[33,43]。本研究结果亦显示，上述指标及总蛋白含量均显著下降，从而证实了制动可诱发肌肉萎缩（图1和图3）。WP-S给药能够逆转由制动引起的这些下降，由此验证了WP-S对抗肌肉萎缩的有效性。肌肉质量、蛋白含量及肌纤维横截面积的减少，源于肌肉蛋白质合成与降解之间的失衡[44]。部分研究表明，肌肉蛋白质合成减少是驱动肌肉萎缩的重要因素[45]，但仍有诸多机制尚待阐明。因此，我们进一步探究了WP-S给药对蛋白质合成与降解的影响。

其他研究表明，制动可抑制PI3K/Akt通路[46,47]，本研究结果与此一致。如图4所示，IM组中PI3K和Akt的磷酸化水平下调，而WP-S处理组则显著上调。活化的Akt通过激活mTOR并抑制FoxO3a来增加净蛋白含量[15]。WP-S给药显著上调了mTOR、4E-BP1和S6K1的磷酸化水平，从而促进了肌肉蛋白质合成。活化的Akt通过磷酸化使FoxO3a失活，因此Atrogin-1、MurF1和Bnip3的表达均显著降低，进而抑制了肌肉蛋白质降解。结合下游蛋白表达来看（4E-BP1、S6K1反映肌肉蛋白质合成；Atrogin-1、MurF1反映肌肉蛋白质降解），肌肉蛋白质合成与降解的总体变化幅度相近。综上所述，WP-S给药增加了净蛋白含量，且对肌肉蛋白合成的促进作用和对肌肉蛋白降解的抑制程度相当。

骨骼肌纤维根据MyHC表达水平的不同被分为慢缩型（Ⅰ型）和快缩型（Ⅱ型）[36,48]。骨骼肌表达四种MyHC亚型：MyHC1（慢缩亚型）以及MyHC2A、MyHC2X和MyHC2B（快缩亚型）。Ⅰ型与ⅡA型肌纤维具有较高的线粒体含量，主要采用氧化代谢；相反，ⅡX型与ⅡB型肌纤维线粒体含量较低，主要采用糖酵解代谢。肌肉活动不足会导致Ⅰ型肌纤维萎缩，并使肌纤维类型从慢缩型（Ⅰ型）转变为快缩型（ⅡA型和ⅡX型）；而衰老则会导致Ⅱ型肌纤维丢失[49,50]。在本研究中，IM组的比目鱼肌和股四头肌的总MyHC含量降低，而WP-S干预组总MyHC含量增加（图5）。最近的一项研究发现，MuRF1可与MyHC结合并通过蛋白酶体途径将其降解[3]。如图2和图4所示，IM显著上调了MurF1的表达水平，而WP-S处理则显著降低；因此，总MyHC含量的表达变化与MurF1的表达变化趋势相反。

在MyHC亚型表达方面，制动使肌纤维类型由慢缩型向快缩型转变，而WP-S处理在比目鱼肌和股四头肌中均可逆转这一转变（图5）。鉴于IM组总MyHC含量降低，这表明制动虽可同时减少慢缩和快缩肌纤维，但对慢缩肌纤维的影响更为显著。此外，WP-S给药虽可增加慢缩和快缩肌纤维，但对慢缩肌纤维的促进作用更为突出。这些趋势与股四头肌和比目鱼肌的肌肉重量变化趋势相一致（图1和图3）。此外，快缩肌纤维的增加可解释握力增强的现象（图1和图3），因为快缩肌纤维通过糖酵解代谢产生强力收缩。鉴于WP-S显著增加了比目鱼肌中I型MyHC的表达，若通过跑台测试等有氧运动能力评估进行检测，WP-S很可能显著提升此类运动能力。综上所述，WP-S给药通过增强总MyHC表达并调控其亚型表达（慢缩型 > 快缩型），从而恢复了制动所致的肌肉丢失。

结论：

可溶性乳清蛋白水解物（WP-S）显著增加了因制动而降低的握力、肌肉质量及肌纤维横截面积。WP-S通过激活肌肉蛋白质合成（PI3K/Akt/mTOR通路）并抑制肌肉蛋白质降解（PI3K/Akt/Foxo3a通路），提高了净蛋白含量。此外，WP-S还增加了总肌球蛋白重链（MyHC）的表达，并改变了其亚型组成。

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